Resumo: Herbaspirillum seropedicae SmR1 é uma ?-proteobactéria capaz de colonizar de forma endofítica diversas plantas de interesse comercial, sugerindo o seu uso como um potencial biofertilizante. Este trabalho é apresentado em dois blocos que descrevem a caracterização de proteínas de H. seropedicae SmR1 envolvidas no metabolismo do polímero polihidroxibutirato (PHB) e na regulação pós-transcricional da expressão gênica, com o objetivo de explorar os mecanismos regulatórios destas proteínas do ponto de vista molecular e estrutural. O capítulo 1 descreve a caracterização das proteínas PhbF e PhaP1 envolvidas no metabolismo de PHB. A capacidade de produzir este poliéster alifático é um importante fator associado à sobrevivência no ambiente em condições de estresse e competitividade com outras bactérias. Este polímero é estocado no interior das células na forma de grânulos cobertos por uma camada de várias classes de proteínas que regulam desde a produção/degradação do polímero, passando por seu tamanho e chegando a transcrição. PhbF está relacionada com a regulação transcricional e PhaP1 ou fasina está envolvida na regulação da relação volume/superfície dos grânulos. Estas proteínas foram expressas de forma heteróloga em Escherichia coli e purificadas com sucesso na forma fusionada a uma cauda de histidinas, utilizando o detergente TritonX-100. Experimentos de gel filtração revelaram PhbF como uma proteína tetramérica e PhaP1 como uma proteína pentamérica, ambas em solução. A proteína PhbF foi capaz de ligar-se a onze prováveis regiões promotoras de genes envolvidos com o metabolismo de PHB em H. seropedicae, confirmando a sua atividade de ligação ao DNA. A análise in silico destas regiões promotoras indicou a sequência consenso 5`-TG[N]TGC[N]3GCAA-3` que foi protegida da ação da DNaseI na região promotora de phbF. Esta proteína foi também capaz de ligar-se ao polímero PHB extraído de H. seropedicae assim como PhaP1. A fasina interagiu fortemente com o PHB e foi capaz de aderir a um filme deste polímero onde foram observadas várias estruturas proteicas individualizadas com dimensão lateral média de 177,8 ± 11,7 Å. Esta dimensão é compatível com a distância máxima de 200 Å calculada para PhaP1 em solução pelo método de SAXS. Esta técnica permitiu também acessar o envelope molecular das proteínas PhbF e PhaP1. Aspectos in vivo relacionados à correlação entre o metabolismo de PHB e a transcrição dos genesphbF e phaP1 foram abordados através de fusões transcricionais ao gene lacZ. PhbF foi capaz de reprimir a sua própria expressão e a do gene phaP1 em E. coli sem a interferência do polímero PHB. Em H. seropedicae, foi possível observar o acoplamento entre a expressão dos genes phbF e phaP1 ao metabolismo de PHB assim como a mobilidade da proteína PhbF entre as formas ligada ao DNA e ligada ao grânulo de PHB. O capítulo 2 descreve a caracterização da chaperona de RNA Hfq de H. seropedicae. Esta é uma proteína homohexamérica, identificada em E. coli como um fator do hospedeiro envolvido na replicação do bacteriófago Q? e como um importante regulador pós-transcricional de vários tipos de RNA afetando uma série de funções bacterianas. A estrutura da proteína Hfq foi determinada por cristalografia de raios-X e espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS). A estrutura cristalográfica revelou uma topologia do tipo Sm conservada, composta por uma ?-hélice N-terminal seguida de cinco fitas ?, e uma nova interação intra-subunidades do tipo empilhamento ?-? entre dois resíduos de histidinas ausente em outras Hfqs com estrutura resolvida. Além disso, o envelope molecular calculado com base nos dados de SAXS concordou com a estrutura cristalográfica, sugerindo que a proteína tem a mesma
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:dspace.c3sl.ufpr.br:1884/32628 |
| Date | 18 October 2013 |
| Creators | Kadowaki, Marco Antonio Seiki |
| Contributors | Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciencias Biológicas. Programa de Pós-Graduaçao em Bioquímica, Steffens, Maria Berenice Reynaud |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPR, instname:Universidade Federal do Paraná, instacron:UFPR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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