Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste pouvant causer des infections pulmonaires chroniques chez les gens atteints de la Fibrose Kystique (FK). Pour réussir à s’implanter dans les voies respiratoires des patients FK, P. aeruginosa dispose d’un important arsenal de facteurs de virulence, dont la sécrétion de protéases, de lipases, de phospholipases ainsi que la production de toxines spécifiques. Le séquençage complet du chromosome de P. aeruginosa souche PAO1 (6.3 Mb) a révélé une organisation génomique hautement régulée. Dans le but de mieux comprendre l’interaction hôte-pathogène, nous avons utilisé la technique de mutagenèse à étiquette (STM). La STM a permis d’isoler 214 mutants incapables de maintenir l’infection pulmonaire chronique chez le rat. Parmi ceux-ci, le mutant STM2895, contenant un transposon dans le gène PA2895, a été retenu pour des analyses plus approfondies. L'étude phénotypique de STM2895 a permis de constater un défaut dans la production d’exoprotéases lorsque comparé à la souche sauvage PAO1. La caractérisation biochimique de ce défaut, utilisant des tests de dégradation spécifiques et l’immunobuvardage, a démontré qu’au moins deux des quatre protéases majeures sécrétées par P. aeruginosa sont impliquées. En effet, les élastases LasA et LasB ont été démontrées non fonctionnelles probablement dues à un problème de repliement. PA2895, une protéine possédant un domaine transmembranaire prédit, ne code pour aucune fonction connue, mais il est co-transcrit avec le gène PA2896, un facteur sigma putatif de type ECF (extracytoplasmic function). Des analyses en transcriptome sur le mutant STM2895, ainsi que sur un mutant de délétion de PA2896, ont permis de lier l’opéron au métabolisme du fer. De plus, des études in vivo dans le modèle d’infection pulmonaire chronique chez le rat ont clairement démontré que le mutant STM2895 est incapable de se maintenir dans l’hôte au même niveau que la souche sauvage PAO1. Le gène PA2895 est donc essentiel au maintien in vivo de P. aeruginosa dans le poumon de rat. / Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen that can cause pulmonary infections in cystic fibrosis patients (CF). To overcome innate self defense, P. aeruginosa possesses a wide arsenal of virulence factors. These include degradation enzymes such as proteases, lipases and phospholipases and the production of three specific toxins: exotoxin A and exoenzymes S and T. Sequencing of the complete P. aeruginosa chromosome (strain PAO1) of 6.3 Mb revealed a highly regulated and complex genomic organization. In order to better understand host-pathogen molecular interactions, we developped a new signature-tagged mutagenesis (STM) approach based on PCR screening. The PCR-based STM technology lead to the identification of 214 mutants deficient in their ability to maintain a chronic pulmonary infection in the rat lung. In that pool of STM mutants, STM2895, which contains a transposon insertion in functional PA2895, was the most frequently drafted during the whole mutant library screening. Phenotypic analyses of the STM2895 strain allowed us to identify an exoprotease production defect as compared with wild type strain PAO1. The biochemical characterization of that proteolytic default using specific degradation assays combined with western blotting revealed that at least two (LasA and LasB) of the four major exoproteases from P. aeruginosa STM2895 strain are inactive. In fact, LasA and LasB elastases were shown to be present in the STM2895 culture supernatant, correctly processed but inactive due to a probable misfolding of proteins. The PA2895 gene (unknown function) encodes a protein with a predicted transmembrane domain. Basic genomic context analyses strongly suggest a cotranscription unit with the downstream gene PA2896, a putative sigma 70 factor from ECF (extracytoplasmic function) type. Microarray experiments on the STM2895 strain and an insertional mutant of the PA2896 gene were performed to establish a link between the putative PA2895-PA2896 operon and the metabolism of iron. Transcriptome analysis also demonstrated a repressive action of PA2895 on the transcription of PA2896 putative sigma factor. Finally, in vivo studies in the rat lung chronic infection model clearly showed a ten-fold decrease in survival capacity of the mutant strain when compared to the PAO1 wild-type strain.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LAVAL/oai:corpus.ulaval.ca:20.500.11794/19067 |
| Date | 12 April 2018 |
| Creators | Potvin, Éric |
| Contributors | Levesque, Roger |
| Source Sets | Université Laval |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | thèse de doctorat, COAR1_1::Texte::Thèse::Thèse de doctorat |
| Format | 284 p., application/pdf |
| Rights | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
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