Un dels avantatges més importants de la cromatografia de líquids d'alta resolució (HPLC) és la seva capacitat de separar diferents substàncies d'una barreja degut a les interaccions que els diferents compostos tenen tant amb la fase estacionària com amb la fase mòbil. Així doncs, entendre la retenció cromatogràfica és un aspecte força interessant ja que, si es coneix com els diferents anàlits es comporten durant el procés d'elució, es poden desenvolupar models que permetin predir la retenció dels anàlits i facilitar així el disseny de mètodes de separació. Addicionalment, per obtenir separacions completes entre anàlits, cal que els pics cromatogràfics no es solapin, per la qual cosa convé que siguin el més estrets possible. Per aquest motiu, comprendre les causes que provoquen l'eixamplament de pic i tractar de minimitzar el seu efecte és també un tema de gran interès a l'hora de realitzar separacions cromatogràfiques. Precisament aquests dos camps, el d'analitzar els factors que contribueixen a l'eixamplament de pic i el de la predicció de la retenció cromatogràfica, són dos dels temes que es tracten en aquesta tesi.
La columna cromatogràfica és l'element que majoritàriament causa que els pics siguin més o menys amples, per la qual cosa caracteritzar la columna i la seva fase estacionària resulta clau per tal d'entendre l'eixamplament de pic. La manera més habitual d'avaluar la qualitat d'una columna és a partir de la coneguda equació de van Deemter i, en el cas d'aquesta tesi, una caracterització més detallada s'ha dut a terme estimant la contribució que cadascun dels seus termes (dispersió d'eddy, difusió i resistència a la transferència de massa) té en l'amplada de pic final. Com a resultat d'aquest estudi, s'ha desenvolupat un full Excel en què aquest procés de caracterització es du a terme de manera sistemàtica.
Quant a l'estudi de la predicció de la retenció, és la fase mòbil la que juga un paper important. La retenció cromatogràfica dels anàlits depèn tant de la fase estacionària com de la fase mòbil, però la facilitat amb la qual es pot modificar aquesta última és la que la fa ser clau en aquest estudi de la retenció. En aquest sentit, la dependència de la retenció d'un anàlit amb la composició de la fase mòbil fa que establir una relació fiable entre aquests paràmetres sigui necessari per tal que els models de predicció que en depenguin siguin acurats, fet que és especialment complicat en mode gradient ja que aquest és un mode d'elució en el que la composició de la fase mòbil varia durant el procés.
Addicionalment, per a anàlits ionitzables, paràmetres fisicoquímics com el pH de la fase mòbil o el pKa del propi anàlit també depenen de la composició de la fase mòbil, fet que fa que predir la retenció d’aquest tipus d’anàlits sigui encara més complicat. En aquest treball es proposa un model que depèn de dos paràmetres, model que s’ha validat per a una gran varietat de condicions experimentals com ara diferents gradients, diversos valors de pH de la fase mòbil i diferents modificadors orgànics. Addicionalment, en aquesta tesi també es proposa una optimització al mètode clàssic de shake-flask per determinar la lipofilicitat de substàncies. Les millores, encarades a satisfer les noves necessitats de la indústria farmacèutica, consisteixen en fer-lo apte per a un interval ampli de lipofilicitat (des de -2 fins a 4.5) i utilitzant una petita quantitat de mostra. D’acord amb aquesta optimització, també es van proposar diferents particions (relacions de volum entre ambdues fases) i es van desenvolupar diversos procediments experimentals capaços de dur a terme les mesures. Els resultats obtinguts van ser força satisfactoris tant a nivell d’exactitud com de precisió. / The main purpose of this PhD thesis is the thorough study of the chromatographic retention in RP-HPLC. In order to achieve this goal, the contributions to chromatographic retention from both the stationary and the mobile phase have been studied, as well as some of the most relevant physicochemical parameters involved in the elution process.
To study the stationary phase, a detailed characterization of chromatographic columns, based on the van Deemter equation, has been performed. In it, the different terms in this equation (eddy dispersion, diffusion and mass transfer) have been assessed individually and their contribution to HPLC band broadening has been evaluated. In this sense this thesis provides an Excel spreadsheet that works as a tool able to characterize stationary phases in a systematic and efficient way. In order to address the chromatographic retention itself several prediction models have been proposed, models that are able to successfully predict the retention in gradient mode of ionizable analytes, both acids and bases. The models have been tested using a selected set of compounds, which includes some drugs with complex structures, under a large variety of experimental conditions such as different mobile phase pH values, different gradient patterns and two different organic modifiers. As an important part to the development of these predicting models, the dependence of several physicochemical parameters (such as the mobile phase pH or the analyte pKa) with the composition of the mobile phase (fraction of organic modifier) has been thoroughly studied.
Additionally, this thesis also proposes an optimization to the well-known shake flask method, the reference method for the determination of drug lipophilicity (both log P and log D parameters). The two key improvements of the suggested optimization are using a low amount of drug and increasing the lipophilicity range where the shake-flask method could be applied, aspects that make the method more suitable for the new needs of the pharmaceutical industry, since companies synthesize their drug candidates, which may have a large variety of lipophilicity values, in low quantities.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UB/oai:www.tdx.cat:10803/345236 |
| Date | 18 November 2015 |
| Creators | Andrés Sanz, Axel |
| Contributors | Bosch, Elisabeth, Rosés Pascual, Martí, Universitat de Barcelona. Departament de Química Analítica |
| Publisher | Universitat de Barcelona |
| Source Sets | Universitat de Barcelona |
| Language | Catalan |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 204 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs., info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0029 seconds