La tasca investigadora realitzada, i recollida en la present Tesi Doctoral, és el resultat de
l'estudi i caracterització de l'especificitat metàl·lica, vers Zn(II), Cu(I) i Cd(II), de diferents
metal·lotioneïnes i de l'anàlisi dels factors que poden determinar aquesta especificitat.
El conjunt de proteïnes estudiades el componen principalment isoformes d’MTs de
mol·luscs: els cargols terrestres H.pomatia i C.aspersum i el barretet marí M.crenulata. L’estudi
de les propietats coordinants d’aquestes proteïnes ha fet possible establir l'existència, en els dos
cargols, d’una isoforma d’MT amb una clara preferència per Cd(II) i d’altres per Cu(I), podent
relacionar aquest comportament amb el rol fisiològic d’aquestes proteïnes (destoxicació de
cadmi i homeòstasi de coure, respectivament). En canvi, M.crenulata té una única MT, McMT,
que no presenta una clara especificitat per Zn(II), Cd(II) o Cu(I), podent participar en ambdós
tipus de processos fisiològics. L'estudi conjunt de les diferents MTs ha permès concloure que
proteïnes similars (contingut en cisteïnes i la seva posició relativa dins la cadena peptídica)
poden presentar especificitats metàl·liques molt diferents, sent els aminoàcids no coordinants
els responsables d’aquesta diversitat.
S’han estudiat també altres MTs: de B.floridae (amfiox) i de D.melanogaster (mosca).
L’amfiox, considerat un organisme model en l’estudi del llinatge evolutiu dels vertebrats, ha
estat àmpliament estudiat a nivell genòmic i proteic, però fins el moment es desconeixia
l’existència d‘MTs. La descripció del seu genoma complert va permetre identificar dues
isoformes d’MT (BfMT1 i BfMT2), que posteriorment varem produir recombinantment. L’estudi
de les característiques coordinants d’aquestes dues proteïnes ha permès establir que BfMT1
presenta una certa especificitat per enllaçar Cu(I) mentre que BfMT2 mostra una major
especificitat metàl·lica per Zn(II) i Cd(II), fets que concorden amb el comportament observat a
nivell genòmic dels seus respectius gens.
D’altra banda, en Drosophila havíem descrit i estudiat 4 isoformes d’MT, totes elles amb
una clara preferència per Cu(I). En aquest treball s’ha estudiat una cinquena MT, MtnE,
descoberta recentment. Els resultats obtinguts indiquen que MtnE és la isoforma amb menor
especificitat per Cu(I) del conjunt d’MTs de D.melanogaster, amb un lloc de coordinació
particular per Zn(II).
Addicionalment, s’ha utilitzat l’acoblament d’un sistema cromatogràfic (size exclusion-
HPLC) amb diferents tipus de detecció (UV-Vis, ESI-MS i ICP-MS) per estudiar l’evolució amb el
temps d’algunes preparacions d’MTs, aquelles riques en lligands sulfur. Els resultats han permès
observar el creixement i compactació dels agregats CdxSy-MT de les preparacions inicials
obtingudes in vivo.
Finalment s'han determinat els paràmetres termodinàmics associats a la reacció de
bescanvi de Zn(II) per Cd(II) en diverses MTs mitjançant la tècnica d'ITC (Isothermal Titration
Calorimetry). Aquest estudi ha permès establir en les MTs estudiades una relació entre els valors
calculats de les constants d’afinitat i l’especificitat metàl·lica vers ions metàl·lics divalents i
monovalents. / The research work embodied in this PhD Thesis is the result of the study and
characterization of the metal specificity, towards Zn (II), Cu (I) and Cd (II), of different
metallothioneins and of the analysis of the factors that could determine this specificity.
The set of studied proteins is mainly composed by mollusc MT isoforms: the terrestrial
snails H.pomatia and C.aspersum and the keyhole limpet M.crenulata. The study of the
coordination properties of these proteins allowed to establish the existence, in both snails, of an
MT isoform with a clear preference for Cd(II) and others to Cu(I), which correlates with their
physiological role (cadminun detoxification and copper homeostasis, respectively). In contrast,
M.crenulata has only one MT, McMT, which does not show any clear specificity for Zn(II), Cd(II)
nor Cu(I), being able to participate in both type of physiological processes. The comparison of
the behaviour of these different MTs allowed to conclude that similar proteins (in terms of
cysteine content and their relative position in the peptide chain) can exhibit very different metal
specificities, being the non-coordinating aminoacids responsible for this diversity.
Others MTs have also been studied: from B.floridae (amphioxus) and D.melanogaster
(fly). Amphioxus, which is considered a model organism for the study of the vertebrates's
evolutive lineage, has been extensively studied at genomic and protein level, but until now the
existence of MTs was not described. The report of its complete genome allowed to identify two
MT isoforms (BfMT1 and BfMT2), which were recombinantly produced in our labs. The study of
their coordinating abilities allowed to observe that BfMT1 shows some specificity to bind Cu(I)
while BfMT2 shows greater specificity towards Zn(II) and Cd(II). This is consistent with the
behavior at genomic level their respective genes.
Already described and studied four MT isoforms in Drosophila, all of them exhibiting a
clear preference for Cu(I). In this work we have studied a fifth MT, MtnE, recently discovered.
The results obtained indicate that MtnE is the isoform with the lowest specificity for Cu(I) among
the set of D.melanogaster MTs, embracing a particular coordination for Zn(II).
Additionally, the coupling of a chromatographic system (size-exclusion HPLC) with
different detection techniques (UV-Vis, ESI-MS and ICP-MS) was carried out in order to study the
time evolution of some MTs preparations, those rich in sulfide ligands. The results allowed to
observe the growth and compactation of the CdxSy-MT aggregates formed in vivo.
Finally, the thermodynamic parameters related with the Zn(II) for Cd(II) replacement
process in various MTs have been determined by means of ITC (Isothermal Titration
Calorimetry). This has allowed to establish a relationship between the calculated values of the
affinity constants of the studied MTs and their metal specificity towards monovalent and
divalent metal ions.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UAB/oai:www.tdx.cat:10803/283210 |
| Date | 20 December 2013 |
| Creators | Pérez Rafael, Sílvia |
| Contributors | Palacios Bonilla, Òscar, Capdevila Vidal, Mercè, Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Química |
| Publisher | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Source Sets | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Language | Catalan |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 368 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs., info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0026 seconds