A malaria humana é uma doença infecciosa transmitida por um mosquito que está atrelada a uma alta taxa de mortalidade. Dentre os parasitas que causam a malaria humana a espécie Plasmodium falciparum é responsável por 90% dos casos letais. Sua virulência é ocasionada por modificações na célula hospedeira provenientes do tráfego de proteínas para a superfície de eritrócitos infectados. Com o intuito de interferir com estas proteínas, aplicamos a técnica Cell- SELEX (do inglês: Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). Após ciclos iterativos de seleção obtivemos moléculas de DNA simples- fita, conhecidas como aptâmeros, que possuem alta afinidade e especificidade contra proteínas alvo presentes na superfície de eritrócitos infectados por P. falciparum. Ensaios de pull- down usando aptâmeros selecionados em sistema de purificação por streptavidina-biotina seguidos por análises de espectrometria de massa revelaram a interação destas moléculas de DNA com proteínas como RIFIN, PfEMP, RAP1, entre outras incorporadas na superfície de eritrócitos infectados. Como consequência destas interações, os aptâmeros selecionados demostraram ser inibidores potenciais na proliferação dos parasitas, como demonstrado por testes in vitro. Outra estratégia usada foi a produção de aptâmeros contra a piridoxal quinase de P. falciparum (PfPdxK) expressa. Usando tanto SELEX-proteína, bem como, ensaios de eletroforese capilar, selecionamos aptâmeros com capacidade para inibir a atividade enzimática da PfPdxK. Nossos dados constituem evidências sobre as aplicações da tecnologia SELEX no desenho racional de compostos contra a malária humana. / The human malaria is a mosquito-borne infectious disease associated with a high risk of mortality. Among the parasite species that causes human malaria, Plasmodium falciparum is responsible by 90% of the lethal cases. The virulence of this pathogen is associated with host cell modifications by trafficking proteins to the surface of infected erythrocytes. Aiming to interfere with these proteins we have applied the Cell-SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) technology. After iterative cycles of selection we obtained single stranded DNA molecules, known as aptamers, with high binding affinity and specificity against protein targets present in the surface of erythrocytes infected with P. falciparum. Pull-down assays using the selected aptamers in a streptavidin-biotin affinity assay followed by mass spectrometry analysis revealed the interaction of these DNA molecules with proteins such as RIFIN, PfEMP, RAP1, among others embedded in the surface of infected erythrocytes. As consequence of these interactions, the selected aptamers demonstrated to be potent inhibitors of parasite proliferation, as validated by in vitro tests. Another strategy used was the production of aptamers against the recombinantly expressed plasmodial pyridoxal kinase (PfPdxK). Using both protein-SELEX as well as capillary electrophoresis assays, we selected aptamers with capacity to inhibit the enzymatic activity of PfPdxK. Our data constitute evidences about the application of SELEX technology in the rationale design of inhibitors against human malaria.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-18052017-132950 |
| Date | 10 November 2016 |
| Creators | Zimbres, Flávia Menezes |
| Contributors | Wrenger, Carsten |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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