Neste trabalho foi utilizado um esquema multi-técnicas para estudar as interações moleculares no mecanismo de ação de clorocatecol 1,2-dioxigenase e da tirosina quinase FGFR2. Na primeira parte desta tese, descrevemos uma série de experimentos envolvendo a interação da enzima clorocatecol 1,2- dioxigenase (1,2-CCD) com seus ligantes naturais e também com miméticos de membranas biológicas (micelas de surfactantes, monacamadas lipídicas e lipossomos). Utilizamos a técnica de calorimetria de titulação isotérmica (ITC) para mostrar que tanto o substrato, quanto o produto da reação inibem a cinética enzimática mediada por 1,2-CCD. Resultados obtidos com as técnicas de calorimetria de varredura diferencial (DSC) e ressonância paramagnética eletrônica (RPE) confirmaram que a inibição se dá devido à ligação direta do produto da reação no sítio catalítico da enzima. Sendo assim, nossos dados indicam que o produto da reação exerce um papel relevante na catálise mediada por 1,2-CCD, devendo ser levado em consideração para estudos futuros que versem sobre a regulação da atividade desta enzima. Em outra vertente, investigamos a capacidade de 1,2-CCD de se ligar a modelos de membranas. Para isso, utilizamos as técnicas de RPE, DSC e de monocamadas de Langmuir no monitoramento das alterações nos miméticos de membranas (micelas dos surfactantes SDS e CTABr, monocamdas de DPPC e lipossomos de DPPC e DMPC) quando da adição de 1,2-CCD. Este conjunto de dados aponta claramente para a existência da referida interação, o que pode representar, junto com a inibição por produto, outro mecanismo de regulação do metabolismo desta enzima dentro da célula. Na segunda parte de nosso estudo, utilizamos a técnica de ITC para acessar as cinéticas de autofosforilação de FGFR2 quinase e de fosforilação, catalisada por FGFR2 quinase, da isoforma p52 da proteína Shc. A fosforilação reversível da cadeia lateral de aminoácidos é um princípio de regulação da atividade de enzimas e sinalização de proteínas largamente utilizado pelas células. Para tornarem-se ativas, proteínas tirosina quinase (PTK) autofosforilam-se hidrolisando moléculas de ATP em ADP em uma reação sequencial e precisamente ordenada. Uma vez ativas, interagem com proteínas adaptadoras, como Shc, que são fosforiladas pelo intermédio de PTK. Assim que é fosforilada, Shc torna-se apta a interagir com outras proteínas importantes no processo de sinalização celular para formar os complexos de sinalização primários (ESC). Nossos resultados mostram que o processo de autofosforilação da FGFR2 é governado por uma cinética cooperativa e com a ordem de fosforilação dos resíduos de tirosina provavelmente idêntica àquela previamente determinada para FGFR1. Já para a fosforilação de Shc, a cinética tende a mudar com a temperatura, sendo que a 10oC ocorre segundo um mecanismo de Michaelis- Menten, enquanto que a 15oC podemos identificar uma indefinição de comportamento deste sistema, uma vez que os dados podem ser ajustados pelos modelos de Michaelis-Menten e Hill. Já para 20oC, vemos uma mudança no perfil catalítico, mostrando um certo grau de cooperatividade. Estes resultados, além de estabelecerem características da cinética de fosforilação de FGFR2 e Shc ainda não reportadas, também validam o método calorimétrico utilizado para determinar os parâmetros cinéticos associados àquele processo. / In this thesis we have used a muti-technique approach to study the molecular interactions relevant in the reaction mechanism of two enzymes: chlorocatechol 1,2 dioxygenase (1,2-CCD) and tyrosine kinase FGFR2. In the first part, we have described a series of experiments involving the interaction of 1,2-CCD with its natural ligands and also with models of biological membranes (micelles, lipid monolayer, and liposomes). Isothermal titration calorimetry (ITC) has shown that both substrate and product of the reactions inhibit 1,2-CCD kinetics. The results from differential scanning calorimetry (DSC) and electron paramagnetic resonance (EPR) have confirmed that inhibition is due to the direct binding of product to the enzyme catalytic site. Thus, our data has indicated that the product of reaction plays a relevant role in the 1,2-CCD catalysis, and should be taken into account in studies related to activity regulation of this class of enzymes. In other study, we have investigated the 1,2-CCD capability of binding to model membranes. For that, EPR, DSC and Langmuir monolayer have been used to monitor changes in the mimetic systems (SDS and CTABr micelles, DPPC monolayer and DMPC liposomes) upon addition of 1,2-CCD to the system. Taken together our data points to existence of the such interaction, which means that this behaviour, along with the product inhibition, could be another mechanism for regulating this enzyme metabolism inside the cell. In the second part of our work, we have used ITC to assess the kinetics of phosphorylation of both FGFR2 kinase and the p52 isoform of Shc. The reversible phosphorilation of tyrosine residues is a widely used mechanism for regulating enzyme activity and protein signalling into the cell. To become active, Tyrosine kinase (PTK) phosphorylates itself by hydrolysing ATP into ADP molecules in a sequential and precisely ordered reaction. When active, PTK interacts with protein partners, like Shc, thus phosphorylating them. After its phosphorylation, Shc interacts with other important proteins in signalling events in order to form the so-called early signalling complexes (ESC). Our results have shown that the FGFR2 kinetics of autophosphorilation happened in a cooperative manner and probably following a phosphorilation order of the Tyr residues similar to that previously reported for FGFR1 kinase. As for the Shc phosphorilation mediated by FGFR2 kinase, it changes with temperature from a regular Michaelis-Menten kinetics at 10oC to an unclear behaviour, adjustable to both Michaelis-Menten and to Hill model, at 15oC. At 20oC, we can see that the kinetics shows some degree of cooperativity. These results provide the kinetic parameters for the FGFR2 authophosphorilation as well as p52Shc phosphorilation that have not been reported before, and also validate the calorimetric methods as a very useful tool to perform kinetics studies related to kinase signalling processes.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-28042010-150101 |
| Date | 26 April 2010 |
| Creators | Fernando Alves de Melo |
| Contributors | Antônio José da Costa Filho, Rosangela Itri, Carlos Alberto Montanari, Marcos Vicente de Albuquerque Salles Navarro, Eneida de Paula |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Física, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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