Η βαριά μυασθένεια (Myasthenia Gravis, MG) είναι μια αυτοάνοση νόσος η οποία χαρακτηρίζεται από διαταραχή στη νευροδιαβίβαση στο επίπεδο της νευρομυϊκής σύναψης. Η διάγνωση της MG βασίζεται στην κλινική συμπτωματολογία η οποία συνεπικουρείται από φαρμακολογικές, ηλεκτροφυσιολογικές και απεικονιστικές δοκιμασίες και επιβεβαιώνεται συνήθως από την ορολογική ανίχνευση αυτοαντισωμάτων έναντι συστατικών της νευρομυϊκής σύναψης. Οι σύγχρονες διαγνωστικές δοκιμασίες είναι συνήθως ικανές προς ανίχνευση της παρουσίας αντισωμάτων στο 85-90% περίπου των μυασθενών με γενικευμένη MG και στο 50% περίπου των ασθενών με οφθαλμική MG. Το κενό αυτό στη διάγνωση της MG δημιουργεί ένα σημαντικό πρόβλημα στις περισσότερες περιπτώσεις που ελέγχονται επειδή ένα αρνητικό αποτέλεσμα (το οποίο είναι το συχνότερο αποτέλεσμα στη συνήθη εργαστηριακή διάγνωση της MG) αφήνει μία ασάφεια σχετικά με την ύπαρξη MG. Πράγματι, ακόμη και ένας πολύ χαμηλός τίτλος θα μπορούσε να είναι επαρκής για να εξηγήσει την παρουσία της μυασθένειας, δεδομένου ότι δεν έχει διαπιστωθεί σημαντική συσχέτιση μεταξύ του τίτλου των αντισωμάτων και της σοβαρότητας της νόσου στον πληθυσμό των ασθενών. Ως εκ τούτου, υπάρχει αυξανόμενη ανάγκη για την ανάπτυξη ιδιαίτερα ευαίσθητων διαγνωστικών μεθόδων, για την αναμφισβήτητη απόδειξη της νόσου. Η πλέον ευαίσθητη διαγνωστική δοκιμασία είναι η ραδιολογική ανοσοκαθίζηση (Radioimmunoprecipitation assay, RIPA) και ο πλέον σημαντικός περιοριστικός παράγων για την ανίχνευση χαμηλού τίτλου αντισωμάτων, είναι η αδυναμία χρήσης μεγάλου όγκου ορού (μέγιστο είναι ~5-20 μl), η οποία θα καθιστούσε αναγκαία την επακόλουθη χρήση υψηλού όγκου αντί-ορού και η οποία θα οδηγούσε σε υπερβολικά μεγάλα άνοσο-ιζήματα, τα οποία με τη σειρά τους συνδέονται με απαράδεκτα επίπεδα μη ειδικού θορύβου υπόβαθρου. Με την ανάπτυξη στην παρούσα μελέτη της RIPA δύο-σταδίων ξεπεράσθηκαν σε μεγάλο βαθμό τα προβλήματα αυτά. Η δοκιμασία αυτή βασίζεται στην ακινητοποίηση του αντιγόνου-στόχου σε ένα αδιάλυτο υπόστρωμα, ακολουθούμενη από την επώαση με μεγάλους όγκους (π.χ. 0,1-1ml) του προς εξέταση ορού και την επακόλουθη απελευθέρωση των προσδεμένων αντισωμάτων με μικρό όγκο διαλύματος χαμηλού pH, τα οποία στη συνέχεια ανιχνεύονται και τιτλοδοτούνται με απλή RIPA με τη χρήση 125I-σημασμένων αντιγόνων. Δηλαδή χρησιμοποιήθηκε η αρχή του καθαρισμού με χρωματογραφία συγγένειας με όχι αυστηρό αλλά με απλό και εύκολο τρόπο, προκειμένου να εμπλουτισθεί ο ορός σε μεγάλο βαθμό στα ειδικά για το αντιγόνο αντισώματα πριν από τον προσδιορισμό και την τιτλοποίηση τους με τις συνήθεις ανοσολογικές δοκιμασίες. Έγινε προσπάθεια ανάπτυξης της προσέγγισης αυτής για την ανίχνευση αντισωμάτων έναντι του AChR και έναντι της MuSK. Έγιναν πολλές προσπάθειες για την εφαρμογή της για την ανίχνευση αντί-AChR αυτοαντισωμάτων. Σημειώθηκε μεγάλη πρόοδος, αλλά απαιτούνται επιπρόσθετες βελτιώσεις για την εφαρμογή της στην διάγνωση ρουτίνας. Για την ανίχνευση των αντί-MuSK αυτοαντισωμάτων με την προσέγγιση αυτή επετεύχθη σημαντικότερη βελτίωση. Η παρούσα συστηματική προσέγγιση απεδείχθη τουλάχιστον 20-50 φορές περισσότερο ευαίσθητη από την κλασική RIPA. Όλοι οι οροί οι οποίοι είχαν χαρακτηρισθεί προηγουμένως ως θετικοί ή αρνητικοί με την κλασική RIPA βρέθηκαν όπως αναμενόταν επίσης θετικοί ή αρνητικοί αντίστοιχα. Επιπλέον όμως μερικοί εκ των ορών οι οποίοι στο παρελθόν είχαν χαρακτηρισθεί ως αμφίβολοι βρέθηκαν σαφώς θετικοί, ή μερικοί άλλοι οι οποίοι είχαν χαρακτηρισθεί ως αρνητικοί αλλά παρουσίαζαν τίτλους ελαφρά υψηλότερους του μηδενός, αλλά όχι στατιστικά σημαντικούς ώστε να αξιολογηθούν ως υψηλότεροι του υπόβαθρου, βρέθηκαν θετικοί, ενώ άλλοι εξακολουθούν να παραμένουν αρνητικοί. Η δοκιμασία που αναπτύξαμε ήταν αρχικά περισσότερο επίπονη από ότι η κλασική RIPA, αλλά με την ανάπτυξη σημαντικών βελτιώσεων, η διαδικασία αυτή έχει απλουστευθεί ώστε να είναι δυνατός ο ταυτόχρονος έλεγχος μεγάλου όγκου (0,1-1 ml) πολλαπλών δειγμάτων ορών και έχει καταστεί δυνατή η χρήση της στην καθημερινή διάγνωση. Η βελτιωμένη αυτή μέθοδος εφαρμόζεται σήμερα για την ανίχνευση αντί-MuSK αντισωμάτων και αποσκοπεί στην ανίχνευση πολύ μικρών ποσοτήτων αυτοαντισωμάτων στον ορό των μυασθενικών οι οποίοι έχουν χαρακτηρισθεί ως οροαρνητικοί ή αμφίβολοι. / Myasthenia Gravis (MG), is an autoimmune disease, characterized by impairment in
neurotransmission at the neuromuscular junction level. The diagnosis of MG is based on
clinical symptomatology, assisted by pharmacological, electrophysiological and imaging
tests and is usually confirmed by serological detection of autoantibodies to components of
the neuromuscular junction. The available diagnostic tests are usually able to detect the
presence of antibodies in 85-90% of myasthenic patients with generalized MG and 50% of
patients with ocular MG. This gap in the diagnosis of MG creates a major problem in most
cases during diagnosis because a negative result (which is the most common result in
ordinary laboratory diagnosis of MG) leaves an ambiguity regarding the existence of
MG. Even a very low titer of specific antibodies, would be sufficient to explain the presence
of myasthenia, since there has been no significant correlation between the titer of antibodies
and the severity of disease among patients. Therefore, there is increasing need for the
development of highly sensitive diagnostic methods for the unambiguous confirmation of the
disease. The most sensitive diagnostic test so far, is the radiological immunoprecipitation
assay (Radioimmunoprecipitation, RIPA) and the most important limiting factor for
detecting low antibody titer, is the inability to use large volumes of serum (maximum is ~ 5-
20 ml), which would require the subsequent use of high-volume of anti-serum, which will
result in excessively large immuno-sediments, which in turn are associated with
unacceptable levels of nonspecific background values.
With the development of two-step RIPA assay in this study we have largely
overcome these problems. This test is based on the immobilization of target antigen to an
insoluble substrate, followed by incubation with large volume (eg 0,1-1ml) of the test serum
and release of bound antibodies with small volume of low pH solution, which are then
detected and titrated with simple RIPA using 125I-labeled antigens. We used the principle of
enrichment of serum to a large extent in antigen-specific antibodies by affinity purification
with no strict but simple and easy way, before the final identification and titration of specific
antibodies with standard immunoassays. We attempted the development of this approach in
order to detect antibodies against AChR and MuSK. Numerous efforts have been made to
implement this method in order to detect AChR autoantibodies, but although there was
substantial progress, additional improvements are required for its application in routine
diagnosis. With this approach we achieved significant improvement for detection of anti-
MuSK autoantibodies. This systematic approach was proved to be at least 20-50 times more
sensitive than classical RIPA. All sera which were previously classified as positive or
negative with standard RIPA were also positive and negative respectively, as expected. In
addition some of the sera which were previously classified as ambiguous were clearly
positive and some others who were classified as negative but were slightly higher than zero,
but not statistically significant so as to assess them as higher than the background, were
positive, while others still remain negative.
This newly developed test was originally more laborious than the classical RIPA, but
with the development of significant improvements, the process has been simplified and
allows the simultaneous testing of large volumes (0,1-1 ml) of multiple serum samples and
its use has been made possible in everyday diagnosis. This improved method is currently
applied to detect anti-MuSK antibodies and is designed to detect very small amounts of
autoantibodies in the serum of myasthenic patients who are classified as seronegative or
ambiguous.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/5400 |
| Date | 23 July 2012 |
| Creators | Τράκας, Νικόλαος |
| Contributors | Τζάρτος, Σωκράτης, Trakas, Nikolaos, Τζάρτος, Σωκράτης, Σιβολαπένκο, Γρηγόριος, Πουλάς, Κωνσταντίνος, Παπαπετρόπουλος, Ανδρέας, Παπαδημητρίου, Ευαγγελία, Σπυρούλιας, Γεώργιος, Πατρινός, Γεώργιος |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 0 |
| Relation | Η ΒΚΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0041 seconds