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Previous issue date: 2008 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Howard Hughes Medical Institute (HHMI) / World Health Organization (WHO) / O tema deste trabalho é estudar alguns fatores importantes de patogenicidade de
fungos do Filo Ascomycota e sua correlação com padrões da dinâmica da expressão gênica na
perspectiva da Evolução Molecular. Decidimos concentrar nossos esforços iniciais nas
questões de sistemática deste grupo, uma vez que a sistemática do Filo Ascomycota, tal como
inferida por métodos atuais, apresenta politomias basais, indicando portanto, controvérsias na
reconstrução dos eventos de radiação evolutiva de seus principais taxa. A análise molecular
descrita neste trabalho sugere a existência de dois grupos na posição basal entre os
ascomicetos filamentosos: os Discomycetes e os Pyrenomycetes. Foram propostos dois
cenários para os principais eventos de radiação daquele filo, o primeiro localizando os
principais eventos na era Proterozóica e o segundo, na era Paleozóica. Para tanto, geramos
um alinhamento de 166 seqüências da subunidade menor do gene ribossômico 18S (SSU
rDNA 18S), representativas de todos os filos de Fungi e utilizamos como base para uma
análise filogenética Bayesiana. A filogenia sugeriu que os Discomycetes são o grupo basal
dentre os ascomicetos filamentosos e provavelmente mantém caracteres ancestrais visto que
seus representantes estão espalhados entre outros grupos de fungos filamentosos. Verificamos
que a taxa evolutiva de heterogeneidade do filo Ascomycota rejeita a hipótese nula de um
relógio molecular global. Para datar os principais eventos da radiação deste filo, foi utilizado o
método “penalized likelihood”, e para calibração, foram incluídos um fóssil de Pyrenomycete
datado em 400 Ma e considerados dois diferentes cenários encontrados na literatura, um com
uma data estimada de 1.576 Ma para a separação entre planta-animal-fungo e outro, com data
estimada de 965 Ma para a separação entre animal-fungo. Estimativas baseadas no primeiro
cenário são mais antigas do que datas propostas em estudos anteriores baseados em
seqüências do rDNA 18S, mas corroboram estimativas baseadas em análises de multiproteínas,
sugerindo que a radiação dos principais grupos de Ascomycota ocorreu na era
Proterozóica. Durante o processo evolutivo, fatores de patogenicidade surgiram dentro do filo
Ascomycota e são encontrados em fungos dos grupos Pezizomycetes, Archiascomycetes e na
Ordem Saccharomycetales. Candida albicans, o patógeno humano oportunista mais
frequentemente isolado, é um representante desta ordem. Sua capacidade de formar biofilmes
confere propriedades importantes para processos infectivos e colonização de diversos
substratos, sendo ainda muito efetiva na resistência às drogas antifúngicas. A descrição e
dinâmica dos componentes moleculares da matriz do biofilme, associados com as mudanças
no metabolismo celular, poderiam explicar, pelo menos em parte, as propriedades em macro
escala desta importante estrutura. Utilizando espectrometria de massa identificamos a enolase
como um dos principais componentes da matriz do biofilme de Candida. Ainda, a presença de
enolase na superfície celular foi confirmada por imunofluorescência. Caracteristicamente, por
ser uma enzima citosólica que participa da via glicolítica, a enolase não possui sinal de
secreção, no entanto, verificamos que a proteína é possivelmente glicosilada e fosforilada.
Análises de degradação e recaptação mostraram que a proteína é degradada a 37o
C e não é
recaptada pela parede celular, sugerindo que exista uma via de secreção não-clássica por
onde a enolase possa ser secretada para o biofilme e para a superfície celular sem ser
degradada no meio externo. A expressão da enolase (ENO1) e das enzimas da via glicolítica
como a hexoquinase, piruvatoquinase e aldolase (HXK1, HXK2, PYK1 e FBA1) de 14
diferentes linhagens de C. albicans que foram cultivadas em condições de crescimento como
biofilme, microaerofilia, hifas e leveduras, não mostraram variação significativa, sugerindo que
a condição de crescimento não afeta a expressão desses genes nas diferentes linhagens
analisadas. Os genes ALS3 e HWP1 codificadores de adesinas tiveram a expressão diminuída
em pelo menos 4 vezes em resposta a diminuição da expressão dos genes TEC1 e BCR1 que
controlam a formação biofilme. Este tipo de regulação sugere que mecanismos de
“feedforward” possam estar presentes nesta rede regulatória. A principal adesina da parede
celular das hifas é Hwp1p, necessária para a formação apropriada de hifas e virulência em
candidíase sistêmica. Nós descrevemos um novo alelo de HWP1 (HWP1-2), que não possui
três importantes regiões, em comparação com o alelo descrito anteriormente (HWP1-1). As
regiões 1 e 2 consistem de 10 aminoácidos repetidos em seqüência, importantes para a
conformação funcional de cadeias peptídicas e a adesão das células de C. albicans ao epitélio
de mamíferos. A região 3 é composta de 34 aminoácidos que promovem a ligação cruzada
com outras proteínas na superfície de C. albicans. As linhagens homozigota para HWP1-2
(L757) e heterozigota (L296) têm níveis significativamente mais baixos na expressão de HWP1
durante a formação de hifas e biofilme, em comparação com a linhagem SC5314 (homozigota
para HWP1-1). L757 teve crescimento na forma de hifa reduzido (40,4%) e diminuída a
formação de biofilme (90,8%), sugerindo que a Hwp1-2p é menos eficiente para manter a
adesão célula-célula e célula-superfície durante a formação do biofilme. Em conjunto nossos
resultados mostram que as propriedades patogênicas de fungos não podem ser seriamente
estudadas sem uma sólida base em sistemática molecular apoiada, por sua vez, nos métodos
explicitamente quantitativos das áreas de Estatística, Teoria de Sistemas Dinâmicos e
algoritmos computacionais. / The aim of this work is the study of factors that are important for the pathogenicity of
the main fungi within phylum Ascomycota and its correlation with expression patterns on the
perspective of Molecular Evolution. We decided to elucidate questions concerning the
systematics of this group, since the actual systematics of the Ascomycota phylum is depicted as
basal polytomies. The molecular analysis described in this work indicates two groups in the
basal position among filamentous ascomycetes: Discomycetes and Pyrenoycetes. Also, two
scenarios are proposed for the major radiation events within that phylum, one places the major
events in the Proterozoic era and the other, in the Paleozoic era. Accordingly, we generated a
dataset of 166 small subunit (18S) rDNA sequences, representative of all groups of Fungi and
used as input in a Bayesian phylogenetic analysis. This phylogeny suggests that Discomycetes
are a basal group of filamentous ascomycetes and probably maintain ancestor characters since
their representatives are intermingled among other filamentous fungi. Also, we show that the
evolutionary rate heterogeneity within Ascomycota rejects the null hypothesis of a global
molecular clock. To estimates the dates of major radiation events, we used the penalized
likelihood method and for calibration we included a 400 My Pyrenomycete fossil. Two distinct
scenarios were considered, being, one with an estimated date of 1.576 Myr for the
plant–animal–fungus split and the other with an estimated date of 965 Myr for the
animal–fungus split. Estimates under the first scenario are older than dates proposed in
previous studies based on small subunit rDNA sequences but support estimates based on
multiprotein analysis, suggesting that the radiation of the major Ascomycota groups occurred
into the Proterozoic era. Pathogenic factors have evolved within Ascomycota and can be found
in fungi of Orders Pezizomycetes, Archiascomycetes and Saccharomycetales. Candida
albicans, the most frequently isolated human opportunistic pathogen, is representative of this
Order. Its ability to form biofilms is a very important factor during the infection process,
colonization of several solid substrates and confers significant resistance to antifungal drugs.
Components of the biofilm matrix associated with changes in the cellular metabolism could, at
least in part, explain its macro-scale properties. We identified that enolase is a major component
of the Candida biofilm matrix by using mass espectrometry and confirmed its presence in the
cell surface by immunefluorescence. Characteristically of cytosolic enzymes that participate of
the glycolytic pathway, enolase does not possess signal for secretion, however, we verified that
this protein can be putatively glycosylated and phosphorylated. Degradation and reuptake
analyses of enolase demonstrated that it is degraded at 37o
C and it is not reuptaked by the cell
wall, which suggests that there is a non-classical secretory pathway by where enolase can be
sent to the biofilm matrix and the cell surface protected against the external medium
degradation. No significant variation in the expression of enolase (ENO1) and glycolytic
pathway enzymes hexokinase, pyruvate kinase and aldolase (HXK1, HXK2, PYK1 and FBA1)
were observed among 14 different lineages of C. albicans grown in biofilm, microaerophilia,
hyphal induced and yeast induced conditions. Adhesin encoding genes ALS3 and HWP1
showed diminished expression levels (at least 4-fold) in response to the down regulation of
biofilm control genes TEC1 and BCR1. This suggests that expression levels of ALS3 and
HWP1 can be regulated by feedforward mechanisms. The major C. albicans hyphae cell wall
adhesin, Hwp1p, is necessary for hyphae formation and virulence in systemic candidiasis. We
described a novel HWP1 allele (HWP1-2) lacking three important regions as compared to the
previously described allele, HWP1-1. Regions 1 and 2 consist of 10 amino acid repeats
important for functional conformation of peptide chains and attachment of C. albicans cells to
the mammalian epithelia. Region 3 consists of 34 amino acid that promote the cross-linking with
other proteins on C. albicans surface. The HWP1-2 homozygous (L757) and heterozygous
(L296) strains have significantly lower levels of HWP1 expression during hyphal growth and
biofilm formation compared to the strain SC5314 (HWP1-1). L757 has reduced hyphal growth
(40.4%) and impaired biofilm formation (90.8%), suggesting that the HWP1-2p is less efficient to
maintain cell-to-cell and cell-to-surface adhesion during biofilm formation. Our results clearly
show that any study of fungal pathogenicity factors have to be solidly based on molecular
systematics, which in turn, has to be grounded on the explicitly quantitative methods of
Statistics, Dynamic Systems Theory and computational algorithms. / BV UNIFESP: Teses e dissertações
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unifesp.br:11600/23716 |
| Date | January 2008 |
| Creators | Padovan, Ana Carolina Barbosa [UNIFESP] |
| Contributors | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Briones, Marcelo Ribeiro da Silva [UNIFESP] |
| Publisher | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | 231 f. |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UNIFESP, instname:Universidade Federal de São Paulo, instacron:UNIFESP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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