Le complexe de liaison de la coiffe des ARN (CBC) joue un rôle essentiel dans leur maturation et déclenche une variété de réactions biochimiques, via son interaction avec différents partenaires. Deux complexes, CBC-ARS2-PHAX (CBCAP), et CBC-ARS2-ZC3H18-NEXT (CBCN), ont récemment été montré comme important pour cibler les ARN vers l'export (CBCAP) ou la dégradation (CBCN). Cependant, les mécanismes par lesquels la sélection se fait pour l'une voie ou l'autre reste mystérieuse. Ainsi, une question majeure qui reste à résoudre est de savoir quand et comment ces complexes sont recrutés sur les ARN. Dans ce travail, j'ai utilisé la procédure du iCLIP (Cross-Linking and Immuno-Precipitation), afin d'identifier les cibles de ces complexes sur l'ensemble du transcriptome humain. J'ai réalisé un iCLIP sur cinq composants de CBCAP et CBCN, et j'ai comparé les résultats à ceux obtenus avec RBM7, un composant de NEXT précédemment étudié par iCLIP. Mes résultats indiquent que: (i) CBP20, ARS2, PHAX et ZC3H18 se lient près de la coiffe des ARN, tandis que RBM7 et MTR4 se lient partout; (ii) CBP20, ARS2, PHAX et ZC3H18 s'associent à un large ensemble d'ARN transcrits par l'ARN polymérase II et montrent une faible sélectivité; (iii) la liaison de ces protéines varie avec l'état de maturation des ARN, avec le CBC enrichi sur les ARN matures, tout comme ARS2/PHAX/ZC3H18 et MTR4 (bien que dans une moindre mesure), tandis que RBM7 est préférentiellement lié sur les pre-mRNAs non épissés; (iv) une liaison différentielle de RBM7 et MTR4 sur les ARN, avec RBM7 enrichi sur les introns et les PROMPTs, et MTR4 plus présent sur les ARN mature. Bien que des expériences additionnelles soient requises, nous proposons que le CBCAP et le CBCN se lient à un même ensemble d'ARN, ce qui indique à la fois une compétition entre ZC3H18 et PHAX pour la liaison à ces ARN, et l'absence de voies de routage bien déterminées qui ciblerait les ARN vers l'une ou l'autre de ces protéines. Le devenir des ARN pourrait ainsi être déterminé par d'autres caractéristiques des ARN, ou encore par des protéines additionnelles. Ces facteurs pourraient s'allier aux protéines liées à la coiffe afin de favoriser la formation du CBCAP ou du CBCN. Dans le but d’identifier des facteurs additionnels, j'ai réalisé un screen d'interaction par spectrométrie de masse après purification de ARS2 ou CBP80. Ceci a été fait dans des conditions natives ou après un cross-link des complexes à la formaldéhyde, afin de stabiliser les interactions transitoires. Ceci a permis d'identifier de nouveaux partenaires de ARS2 et de CBP80, dont la majorité sont impliqués dans l'épissage des ARN. Des expériences additionnelles seront nécessaires pour valider ces interactions. / The cap-binding complex (CBC) plays a pivotal role in post-transcriptional processing events and orchestrates a variety of metabolic pathways, through association with different interaction partners. Two CBC sub-complexes, the CBC-ARS2-PHAX (CBCAP) and the CBC-nuclear exosome targeting (NEXT) complex (CBCN), were recently shown to target capped RNA either toward export or degradation, but the mechanisms by which they can discriminate between different RNA families and route them toward different metabolic pathways still remain unclear. A major question to be answered is how and when the different CBC subcomplexes are recruited to the RNP. Here, we used an individual nucleotide-resolution UV cross-linking and immunoprecipitation (iCLIP) approach to identify the transcriptome-wide targets for 5 different components of the CBCAP and CBCN complexes, and compared results to the previously analysed NEXT-component RBM7. We report that: (i) CBP20, ARS2, PHAX and ZC3H18 bind close to the cap, while RBM7 and MTR4 bind throughout the mRNA body; (ii) CBP20, ARS2, PHAX and ZC3H18 associate with a broad set of RNA polymerase II (PolII)-derived RNAs and have only mild species preferences; (iii) binding varies with the RNA maturation stage, with the CBC being highly enriched on mature mRNA, ARS2/PHAX/ZC3H18/MTR4 less so, and RMB7 preferentially bound to pre-mRNAs; (iv) MTR4 and RBM7 show different specificities, with RBM7 being highly enriched on introns and promoter upstream transcripts (PROMPTs), while MTR4 is additionally present on mature RNAs. Although more experimental work is needed to fully support our model, we propose that CBCAP and CBCN bind overlapping sets of RNAs, indicating a competition between the proteins ZC3H18 and PHAX, and the lack of a strict RNA sorting mechanism. RNA fate may therefore be determined by additional RNA features and/or by other RNA-binding proteins, which may synergize with the cap and drive the formation of one specific CBC subcomplex instead of another. In an attempt to identify yet unknown factors that may interact with cap-bound CBCAP and CBCN, we performed a protein interaction screen leveraging affinity capture-mass spectrometry (ACMS), using ARS2 and CBP80 as bait proteins. As a complementary approach, we also employed a formaldehyde-based chemical cross-linking strategy, aimed at stabilizing weak/transient interactions. Although we failed to detect any transient interactions involving the CBC, we identified several potential CBC80 and ARS2 interactors, the majority of which are involved in pre-mRNA splicing. Additional quantitative experiments are required to validate our ACMS results and confirm the existence of such protein interactions in vivo.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2016MONTS028 |
| Date | 11 April 2016 |
| Creators | Giacometti, Simone |
| Contributors | Montpellier, Bertrand, Édouard, Jensen, Torben Heick |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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