Le complexe de liaison de la coiffe des ARN (CBC) joue un rôle essentiel dans leur maturation et déclenche une variété de réactions biochimiques, via son interaction avec différents partenaires. Deux complexes, CBC-ARS2-PHAX (CBCAP), et CBC-ARS2-ZC3H18-NEXT (CBCN), ont récemment été montré comme important pour cibler les ARN vers l'export (CBCAP) ou la dégradation (CBCN). Cependant, les mécanismes par lesquels la sélection se fait pour l'une voie ou l'autre reste mystérieuse. Ainsi, une question majeure qui reste à résoudre est de savoir quand et comment ces complexes sont recrutés sur les ARN. Dans ce travail, j'ai utilisé la procédure du iCLIP (Cross-Linking and Immuno-Precipitation), afin d'identifier les cibles de ces complexes sur l'ensemble du transcriptome humain. J'ai réalisé un iCLIP sur cinq composants de CBCAP et CBCN, et j'ai comparé les résultats à ceux obtenus avec RBM7, un composant de NEXT précédemment étudié par iCLIP. Mes résultats indiquent que: (i) CBP20, ARS2, PHAX et ZC3H18 se lient près de la coiffe des ARN, tandis que RBM7 et MTR4 se lient partout; (ii) CBP20, ARS2, PHAX et ZC3H18 s'associent à un large ensemble d'ARN transcrits par l'ARN polymérase II et montrent une faible sélectivité; (iii) la liaison de ces protéines varie avec l'état de maturation des ARN, avec le CBC enrichi sur les ARN matures, tout comme ARS2/PHAX/ZC3H18 et MTR4 (bien que dans une moindre mesure), tandis que RBM7 est préférentiellement lié sur les pre-mRNAs non épissés; (iv) une liaison différentielle de RBM7 et MTR4 sur les ARN, avec RBM7 enrichi sur les introns et les PROMPTs, et MTR4 plus présent sur les ARN mature. Bien que des expériences additionnelles soient requises, nous proposons que le CBCAP et le CBCN se lient à un même ensemble d'ARN, ce qui indique à la fois une compétition entre ZC3H18 et PHAX pour la liaison à ces ARN, et l'absence de voies de routage bien déterminées qui ciblerait les ARN vers l'une ou l'autre de ces protéines. Le devenir des ARN pourrait ainsi être déterminé par d'autres caractéristiques des ARN, ou encore par des protéines additionnelles. Ces facteurs pourraient s'allier aux protéines liées à la coiffe afin de favoriser la formation du CBCAP ou du CBCN. Dans le but d’identifier des facteurs additionnels, j'ai réalisé un screen d'interaction par spectrométrie de masse après purification de ARS2 ou CBP80. Ceci a été fait dans des conditions natives ou après un cross-link des complexes à la formaldéhyde, afin de stabiliser les interactions transitoires. Ceci a permis d'identifier de nouveaux partenaires de ARS2 et de CBP80, dont la majorité sont impliqués dans l'épissage des ARN. Des expériences additionnelles seront nécessaires pour valider ces interactions. / The cap-binding complex (CBC) plays a pivotal role in post-transcriptional processing events and orchestrates a variety of metabolic pathways, through association with different interaction partners. Two CBC sub-complexes, the CBC-ARS2-PHAX (CBCAP) and the CBC-nuclear exosome targeting (NEXT) complex (CBCN), were recently shown to target capped RNA either toward export or degradation, but the mechanisms by which they can discriminate between different RNA families and route them toward different metabolic pathways still remain unclear. A major question to be answered is how and when the different CBC subcomplexes are recruited to the RNP. Here, we used an individual nucleotide-resolution UV cross-linking and immunoprecipitation (iCLIP) approach to identify the transcriptome-wide targets for 5 different components of the CBCAP and CBCN complexes, and compared results to the previously analysed NEXT-component RBM7. We report that: (i) CBP20, ARS2, PHAX and ZC3H18 bind close to the cap, while RBM7 and MTR4 bind throughout the mRNA body; (ii) CBP20, ARS2, PHAX and ZC3H18 associate with a broad set of RNA polymerase II (PolII)-derived RNAs and have only mild species preferences; (iii) binding varies with the RNA maturation stage, with the CBC being highly enriched on mature mRNA, ARS2/PHAX/ZC3H18/MTR4 less so, and RMB7 preferentially bound to pre-mRNAs; (iv) MTR4 and RBM7 show different specificities, with RBM7 being highly enriched on introns and promoter upstream transcripts (PROMPTs), while MTR4 is additionally present on mature RNAs. Although more experimental work is needed to fully support our model, we propose that CBCAP and CBCN bind overlapping sets of RNAs, indicating a competition between the proteins ZC3H18 and PHAX, and the lack of a strict RNA sorting mechanism. RNA fate may therefore be determined by additional RNA features and/or by other RNA-binding proteins, which may synergize with the cap and drive the formation of one specific CBC subcomplex instead of another. In an attempt to identify yet unknown factors that may interact with cap-bound CBCAP and CBCN, we performed a protein interaction screen leveraging affinity capture-mass spectrometry (ACMS), using ARS2 and CBP80 as bait proteins. As a complementary approach, we also employed a formaldehyde-based chemical cross-linking strategy, aimed at stabilizing weak/transient interactions. Although we failed to detect any transient interactions involving the CBC, we identified several potential CBC80 and ARS2 interactors, the majority of which are involved in pre-mRNA splicing. Additional quantitative experiments are required to validate our ACMS results and confirm the existence of such protein interactions in vivo.

Dans les cellules eucaryotes, lexport des ARN messagers du noyau vers le cytoplasme est un processus complexe et régulé. Les messagers matures sont transportés par le récepteur dexport TAP/NXF1, qui est recruté au niveau des messagers par différents adaptateurs comme les protéines Aly/REF, UAP56 et les protéines SR. Dans le cadre dune infection virale, en plus des messagers cellulaires, de nombreux messagers viraux doivent être transportés efficacement dans le cytoplasme pour y être traduits. Il est maintenant établi que les herpesvirus codent pour une famille conservée de gènes dont les produits agissent en tant que facteurs dexport et régulent le transport des transcrits viraux. Cette famille inclut la protéine IE4 du virus de la Varicelle et du Zona (VZV). Les principales caractéristiques de ces facteurs dexport viraux sont leur capacité à faire la navette entre le noyau et le cytoplasme, leur domaine de liaison à lARN, et leur capacité à interagir avec des facteurs intervenant dans lexport des messagers cellulaires. Avant cette étude, les données montraient que la protéine IE4 agit comme un régulateur important de lexpression des gènes viraux et cellulaires, mais les mécanismes impliqués nétaient pas clairement définis. Dans ce travail, nous avons identifié de nouveaux partenaires cellulaires de la protéine IE4, et, bien que des différences existent, nous avons montré que la protéine IE4 partage les caractéristiques des facteurs dexport viraux. Nous avons montré que la protéine IE4 interagit avec trois protéines SR, à savoir ASF/SF2, 9G8 et SRp20. Nous avons identifié le domaine dinteraction au sein de la protéine IE4 et montré que ces interactions ne sont pas dépendantes de la présence dARN. Nous avons démontré que la protéine IE4 interagit avec la principale kinase phosphorylant les protéines SR, SRPK1, et quelle est phosphorylée par cette kinase. Nous avons montré que la protéine IE4 se lie à lARN, et que la présence dARN stabilise des complexes contenant la protéine IE4 et les facteurs dexport cellulaires TAP/NXF1 et Aly/REF. Enfin, nous avons déterminé linfluence de la protéine IE4 sur lexport de messagers rapporteurs, et clairement montré que linfection par le VZV utilise le facteur dexport TAP/NXF1 pour exporter certains transcrits viraux. Nous avons donc mis en évidence un nouvel exemple de facteur dexport viral et proposé en modèle dexport des messagers viraux régulé par la protéine IE4. Nos résultats démontrent clairement que les herpesvirus ont développé différents mécanismes pour réguler lexport des ARN dans le but daltérer lexpression des gènes cellulaires au profit de lexpression des gènes viraux.

The human genome is highly heterogeneous in its GC composition. How codon usage affects translation rates has been extensively studied and exploited to increase protein expression. Although effects on virtually all other steps in gene expression have been reported as well, so far no systematic approach has been taken to quantitatively measure the contribution of each to overall protein levels in human cells. Here, I utilise a library of several hundred synonymous variants of the Green fluorescent protein (GFP) to characterise the influence of codon usage on gene expression in human cells. In an initial small-scale screen, I show that protein levels are largely correlated with codon-usage and particularly GC-content. Additionally, I demonstrate that these changes can already be seen on the RNA level, confirming more broadly previously published data from our lab (Kudla et al., 2006). In order to assess the consequences of randomised codon usage on a larger scale, I established and validated a high-throughput approach for the phenotypic profiling of reporter genes. Using a pool of cells stably expressing >200 GFP variants, I measured multiple parameters simultaneously, such as protein levels, translational state, RNA levels, stability and export. Data from these experiments confirm a strong relationship between GC-content, protein levels, as well as RNA export, reproducibly in two cell lines. Low expression of especially GC-poor variants could not be rescued by splicing, but increased nuclear-to-cytoplasmic RNA ratio, suggesting further mechanisms important for efficient gene expression. These effects are even more pronounced when the distribution of GC is spread evenly along the coding sequence. Interestingly, our data also suggests that high GC within the first 200nt is more predictive of efficient gene expression, contrasting studies performed on bacteria, in which strong secondary folding near the ribosomal binding site was shown to be non-permissive for translation (Kudla et al., 2009). By relating experimentally derived parameters to sequence features known to inhibit expression, I demonstrate that cryptic splicing is a major factor leading to decreased levels of particularly GC-poor GFP variants. An attempt to quantitatively assess the relative contribution of several sequence features (e.g. tAI, GC3, CpG) using multiple regression analysis lead to inconclusive results, leaving the requirement for the exploration of alternative approaches in order to dissect the role of individual parameters, as well as to identify novel determinants of gene expression.

Protective antiviral immune responses require priming of naïve T cells by dendritic cells (DCs) that have matured sufficiently to produce co-stimulatory cell surface molecules and cytokines. Although only low levels of productive HIV-1 infection are detected in ex vivo DCs following HIV-1 challenge, those few cells exhibit innate activation. Experimentally bypassing blocks to entry and replication leads to more efficient transduction of DCs and maturation as indicated by production of interferons and interferon stimulated genes. Furthermore, similar innate activation occurs upon transduction of macrophages or CD4+ T cells. However, the mechanism by which HIV-1 is detected to activate innate immune signaling is not clear. The purpose of this thesis is to incorporate my data and observations into the understanding of HIV-1 innate detection and attempt to resolve seemingly conflicting observations. Reverse transcription and genomic integration are necessary for innate activation implying the need de novo transcription. Coding sequences are unnecessary save for those cis-acting sequences necessary for the HIV-1 life cycle. CRM1 dependent, HIV-1 unspliced RNA export is essential for innate activation. As intact viral sequence is unnecessary for transcription and export, defective proviruses may contribute to systemic inflammation seen in chronically infected individuals. These insights, are hoped to aid in the production of qualitatively better anti-retroviral drugs as well as in the design a protective HIV vaccine.