Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1
4098.pdf: 4555828 bytes, checksum: eeec91702a4d283144c291e30559f09c (MD5)
Previous issue date: 2011-02-18 / In this paper we proposed and analyzed methodologies using the technology of Cell-Free Fetal Nucleic Acid-Free (cffDNA = Cell Free Fetal DNA) in noninvasive prenatal diagnosis (NIPD). Due to the modern technologies employed and their repercussion among the involved families, we sought to discuss some ethical, social and legal implications. Contrary to the popular belief that the placenta forms an impermeable barrier between mother and child, there is bidirectional traffic between the fetus and mother during pregnancy. Several studies have shown that not only intact cells but also fetal cell-free fetal nucleic acids (cffNA, ie, DNA and RNA) cross the placenta and travels in the mother's bloodstream. Four different applications of analysis technology were identified: cffDNA: a) Prenatal Sex Determination, used in pregnancies under the risk of sexual transmitted diseases and performed through the detection of the Y chromosome b) The diagnosis of certain diseases of a single gene through the detection of paternally inherited mutation c) Fetal Aneuploidy, such as Down syndrome, where chromosomal abnormalities may occur d) identifying the type of fetal blood in pregnancies under the risk of incompatibility, especially RhD. To carry out this work it was used the pre-natal determination of sex in 53 pregnant women at different gestational periods. For that it was proposed and tested methods of DNA extraction, amplification of DNA obtained by PCR (Polymerase Chain Reaction) and a new methodology called LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification) and the analysis of final results. Furthermore, the efficiency of LAMP and PCR was compared by amplifying different segments of the Y chromosome: DSY14 and TSPY. In three cases the samples were discarded because there was no fetal sex confirmation after molecular tests due to loss of contact with pregnant women. In two other cases the results pointed to male fetuses whilst the ultrasound confirmed these fetuses as females due to contamination. Finally it was obtained 28 male samples (58.33%) with amplification of the sequences of the Y chromosome and 20 female samples (41.67%) that did not amplify the sequence of the Y chromosome but only for the control. These results showed that the amplification lamp is more efficient than PCR, in the analysis of DSY14, the limit of detection is 10 pg and 0.1 pg for LAMP and PCR respectively. It was concluded that the amplification using the LAMP method is faster (60 min) and has a high sensitivity and specificity and does not require sophisticated equipment for reaction if compared to the PCR method. These characteristics make this methodology feaseable in laboratories with limited resources. / Neste trabalho propusemos e analisamos metodologias empregadas no uso da tecnologia dos Ácidos Nucléicos Livres de Células Fetais (cffDNA = Cell Free Fetal DNA) no diagnóstico pré-natal não invasivo (DPIN = Non-invasive Prenatal Diagnosis). Dada a modernidade das tecnologias empregadas e a sua repercussão nas famílias envolvidas, procuramos discutir algumas implicações éticas, sociais e legais. Ao contrário da crença popular de que a placenta constitui uma barreira impermeável entre mãe e filho, há tráfego bidirecional entre o feto e a mãe durante a gravidez. Vários estudos têm demonstrado que tanto células fetais intactas e ácidos nucléicos livres de células fetais (cffNA, ou seja, DNA e RNA) atravessam a placenta e circulam na corrente sanguínea materna. Identificamos quatro diferentes aplicações da tecnologia de análise do cffDNA: a) Determinação pré-natal do sexo, utilizada em gestações com risco de uma doença ligada ao sexo e realizada através da detecção do cromossomo masculino Y; b) O diagnóstico de certas doenças de gene único, normalmente através da detecção de mutação herdada paternalmente; c) Aneuploidia fetal, tal como a Síndrome de Down, onde há alterações cromossômicas; d) Detecção do tipo de sangue fetal em gestações com risco de incompatibilidade, sobretudo RhD. Para realizar este trabalho utilizamos a determinação pré-natal do sexo em 53 gestantes em diferentes períodos gestacionais. Para tal, testamos e propusemos metodologias de extração do DNA; amplificação do DNA extraído através da técnica da PCR (Polymerase Chain Reaction) e de uma nova metodologia denominada LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification); e a análise final dos resultados. Além disso, comparamos a eficiência da PCR e LAMP amplificando diferentes segmentos do cromossomo Y: DSY14 e TSPY. Em três casos as amostras foram descartadas porque não houve a confirmação do sexo fetal após os testes moleculares devido à perda de contato com as gestantes. Em outros dois casos os resultados apontaram para fetos masculinos, entretanto, no ultra-som eles foram confirmados como femininos, provavelmente devido a uma contaminção. No final obtivemos 28 amostras (58,33%) masculinas, com a amplificação das sequências do cromossomo Y e 20 amostras (41,67%) femininas que não amplificaram a sequência do cromossomo Y e apenas para o controle. Nossos resultados demonstraram que a amplificação por LAMP é mais eficiente que a PCR na análise de DSY14, sendo que o limite de detecção é de 10 pg e 0,1 pg, para a PCR e o LAMP, respectivamente. Concluímos que a amplificação utilizando a metodologia de LAMP é mais rápida (60 minutos) e apresenta uma alta especificidade, sensibilidade e não requer equipamentos sofisticados para reação, comparada com a técnica da PCR. Tais características viabilizam esta metodologia em laboratórios com poucos recursos.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufscar.br:ufscar/6993 |
| Date | 18 February 2011 |
| Creators | Rocha, Bruno Garcia |
| Contributors | Matheucci Junior, Euclides |
| Publisher | Universidade Federal de São Carlos, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, UFSCar, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSCAR, instname:Universidade Federal de São Carlos, instacron:UFSCAR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0026 seconds