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Lectina de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus): identificação, purificação, caracterização gênica e avaliação de atividade imunomoduladora

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Previous issue date: 2012 / FACEPE / Lectinas são proteínas ligantes de glicanos conhecidas para desempenhar papéis-chave na imunidade inata e resistência a doenças em peixes. O principal objetivo desse estudo foi identificar, purificar e caracterizar lectinas imuno-ativas presentes nos tecidos (baço e rim) e no soro da tilápia do Nilo, Oreochromis niloticus, um ciclídeo africano, considerado o carro-chefe da piscicultura brasileira. Inicialmente o DNA genômico obtido a partir dos tecidos da tilápia pelo protocolo CTAB 2% foi amplificado por PCR usando primers desenhados por homologia com diferentes organismos, purificado, sequênciado e analisado com ferramentas da bioinformática disponíveis em diferentes bancos de dados públicos. A partir dos tecidos renais foi possivel obter uma banda única, com concentração 40,5 ng/μL e alta qualidade (A260/A280 = 1,8), verificada em espectrofotômetro. A sequência (969pb) foi denominada receptor de lectina tipo C de Oreochromis niloticus (OniLCLR) e quando analisada pelo Blastn/NCBI, exibiu padrões não convencionais que reconhecem pequenos fragmentos de sequências de DNA, sem homologia tradicional (baixa identidade), no entanto, apresentou semelhanças com vários genes relacionados ao sistema imune e diferentes aspectos funcionais. OniLCLR contém ORF que codificam dois peptídios: um é homólogo ao domínio de lectina tipo C, membro da família A-10, denominado OniLCLEC10A (47% de identidade) e o outro homólogo ao Receptor-1 de lipoproteína oxidada de baixa densidade (25% de identidade), nomeado OniLORL1, ambos pertencentes à família dos receptores de lectina tipo C. As análises das relações entre as sequências, estruturas e funções desses peptídios revelaram que essas lectinas desempenham papéis essenciais como antígeno de superfície celular, inflamação e na arteriogênese, sugerindo seus envolvimentos no sistema imune da tilápia. Em outra abordagem, uma nova proteína denominada lectina de Oreochromis niloticus (OniL) foi purificada e parcialmente caracterizada a partir do soro do peixe. A purificação foi realizada por precipitação com sulfato de amônio (fração F20-40%) e pelo método cromatográfico em matriz de afinidade Con A Sepharose 4B, eluída com metil-α-D-manopiranosídeo (200 mM) em TBS. Foram avaliados parâmetros tais como especificidade a carboidratos, testes de temperatura e íons, eletroforese SDS-PAGE e PAGE. Ensaios imunológicos, in vitro, para avaliar a atividade imunomoduladora em culturas experimentais de esplenócitos de camundongos BALB/C também foram conduzidos. Índices de citotoxidade, níveis de produção de citocinas e o tipo de resposta imune celular foram avaliados. OniL apresentou massa molecular 17 kDa constituída por duas subunidades de 11 e 6,6 kDa, em condições redutoras, indicando a presença de pontes dissulfeto. OniL apresentou afinidade para os carboidratos metil-α-D-manopiranosídeo e D-manose. A atividade de Onil foi completamente abolida em temperaturas acima de 70 °C. A adição de EDTA diminuiu sua atividade e revelou que OniL é Ca2+ dependente. Os ensaios imunológicos demonstraram que OniL não apresenta citotoxicidade em esplenócitos de camundongos, induziu elevada produção de IFN-γ, baixa produção de IL-10 e não foi eficiente na liberação de óxido nítrico. A secreção de IFN-γ estimulada por OniL revelou diferenciação de células preferencialmente do tipo Th1, assim, sugere-se que esta proteína seja um potencial imunomodulador em mamíferos.

Identiferoai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpe.br:123456789/12744
Date31 January 2012
CreatorsLino, Mércia Andréa da Silva
ContributorsCoelho, Luana Cassandra Breintenbach Barroso
PublisherUniversidade Federal de Pernambuco
Source SetsIBICT Brazilian ETDs
LanguageBreton
Detected LanguagePortuguese
Typeinfo:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
Sourcereponame:Repositório Institucional da UFPE, instname:Universidade Federal de Pernambuco, instacron:UFPE
RightsAttribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/, info:eu-repo/semantics/openAccess

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