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Previous issue date: 2016-02-23 / O P2X7 é um receptor purinérgico que está envolvido em importantes funções fisiológicas e metabólicas, mas também tem participação em diversas patologias, principalmente aquelas de caráter inflamatório. Apesar de sua relevância, ainda não se têm disponíveis antagonistas específicos que possam ser utilizados na clínica para o tratamento de doenças relacionadas à ativação deste receptor. Muitos fármacos comercializados nos dias de hoje apresentam estruturas químicas relacionadas a um produto natural extraído de alguma espécie botânica de uso consagrado na medicina popular. Baseia-se nisso a relevância do estudo de produtos naturais para obtenção de uma atividade específica sobre alvos celulares. Logo, esse trabalho teve como interesse o estudo de extratos vegetais e fúngicos obtidos de espécies dos diferentes biomas, cedidos pelo LQPN do Centro de Pesquisas René Rachou \2013 Fiocruz-MG, visando á identificação de antagonistas para o receptor P2X7. Nosso primeiro passo foi à padronização de uma metodologia que permitiu a triagem de cerca de 60 extratos ao mesmo tempo, através da utilização de um espectrofotômetro de placas. Depois de padronizada, promovemos a aplicação dessa metodologia na triagem de 1800 extratos, dos quais apenas três extratos (8067,8549 e 8568) apresentaram atividade antagonista na faixa de corte pré-estabelecida [100 \03BCg/mL], com perfis de inibição de 65 %, 62 % e 61 % respectivamente, sobre o P2X7R. Destes extratos foram determinados os IC´s50 tanto em células de linhagem murina (2,1 \03BCg/mL; 2.6 \03BCg/mL e 3.8 \03BCg/mL) quanto em células de linhagem humana (0.69, 0.92 e 1.5 \03BCg/mL), sendo possível verificar maior atividade quando testados em células de linhagem humana
Posteriormente avaliamos a ação destes sobre funções fisiológicas relacionadas à ativação do P2X7R, nessa etapa, observamos o efeito inibitório destes extratos sobre a liberação de IL-1beta, ROS e NO, onde os três compostos foram capazes de inibir estas funções numa faixa entre 50 % a 60 %. Para obtermos uma caracterização do efeito farmacológico destes extratos sobre o receptor P2X7, realizamos experimentos de eletrofisiologia, caracterizando assim uma ação inibitória dose-dependente destes, sendo que nos respectivos IC´s50 os perfis de inibição da corrente foram de: 76 %, 47 % e 75 %. Também avaliamos a citotoxicidade in vitro utilizando as células de ambas às linhagens e verificamos que não apresentaram significativa toxicidade quando tratadas por 24 h. em doses até quatro vezes maiores que o IC50, visto que os resultados foram semelhantes ao controle não tratado. Depois de avaliarmos a atividade antagonista destes extratos in vitro, partimos para os experimentos in vivo utilizando os modelos de úlcera induzida por etanol e de dor neuropática e inflamatória, pois existem trabalhos previamente descritos na literatura que correlacionam a atividade do P2X7R com a evolução dessas patologias. No ensaio de dor neuropática, apenas dois extratos mostraram atividade analgésica (8067 e 8549) inibindo o estímulo de dor em 68 % e 66 %, porém no contexto da dor inflamatória os três extratos mostraram efeito analgésico, inibindo o estímulo em: 8067 = 48%, 8549 = 50% e 8568 = 44 %
Os resultados obtidos do experimento de úlcera induzida por etanol demonstraram o efeito inibitório sobre a formação de úlceras desses extratos em: 88 %, 84 % e 51 %, inclusive foram mais efetivos que o BBG (antagonista reversível deste receptor) e que o medicamento utilizado na clínica (Lansoprazol), os quais inibiram a formação de úlceras em 43 % e 46% respectivamente. Nosso conjunto de resultados apontam extratos com significativa atividade antagonista sobre o P2X7R, com potencial para o desenvolvimento de novos fármacos com grande interesse para a indústria farmacêutica, além de contribuir para o conhecimento acerca de propriedades medicinais presentes na biodiversidade / The purinergic receptor P2X7 is involved in important physiological and metabolic
functions, but it also participates in pathology, especially when inflammatory in character. Despite
the importance of P2X7, it has no specifi
c antagonists yet available for use in clinical treatment of
diseases related to the receptor's activation. Today, many drugs on the market have chemical
structures related to natural products obtained from botanical species with traditional use in
indigen
ous medicine, forming the basis for studying natural products to obtain specific activity on
cellular targets. This work focused primarily on the study of plant and fungal species extracts
obtained from different biomes provided by LQPN of the Research Cen
ter René Rachou
-
Fiocruz
-
MG, aiming to identify antagonists for the P2X7 receptor. The first step was to standardize a
method that allowed the screening of approximately 60 extracts at the same time through the use of
a plate spectrophotometer. Once stand
ardized, the application of this methodology was promoted in
the screening of 1800 extracts. Of these, only three extracts (8067, 8549 and 8568) showed
antagonistic activity in the pre
-
established cut range [100 mg/mL], with inhibition profiles of 65%,
62%
, and 61% respectively, on the P2X7R. Th
e
IC's50
of them were determinate
in murine (2.1,
2.6, and 3.8 mg/mL) and human (0.69, 0.92, and 1.5 mg/mL) cell lines.
Which an increased activity
was possible to verify when they were tested
in human cells. Consequ
ent evaluation of action on
physiological functions related to the activation of P2X7R revealed an inhibitory effect of these
extracts on the release of IL
-
1beta, NO, and ROS. The three tested compounds were able to inhibit
these functions in a range betwe
en 50% and 60%. To obtain a pharmacological characterization of
these extracts on the P2X7 receptor, electrophysiological experiments were conducted, which
characterized the dose
-
dependent inhibitory effects, exhibiting inhibitory current profiles of 76%,
47%, and 75%, respectively. In vitro cytotoxicity was also evaluated, using both cell strains,
showing no significant toxicity after 24 hours of treatment at doses of up to four times that of the
IC50; the results were similar to the untreated control. Aft
er evaluating the antagonistic activity of
these extracts in vitro, experiments using the in vivo models of ethanol
-
induced ulcers and
inflammatory and neuropathic pain were performed. Previous studies correlate the activity of the
P2X7R with the evolution
of these pathologies. In the neuropathic pain protocol experiment, only
two extracts showed analgesic activity (8067 and 8549) by inhibiting the pain stimulation by 68%
and 66%, but in the context of inflammatory pain, the three tested extracts showed ana
lgesic effects
by inhibiting the stimulus by the following percentages: 8067 = 48 %, 8549 = 50%, and 8568 =
44%. The results of the ethanol
-
induced ulcer demonstrated an inhibitory effect on the ulcer’s
development of 88%, 84%, and 51% by these extracts, a
nd found that the extracts were more
effective than BBG (reversible antagonist of this receptor) and the medicine used clinically
(Lansoprazole), which inhibited the formation of ulcers by 43% and 46%, respect
ively. The data set
links to extracts
with significant antagonist activity on the P2X7R,
and potential to the development xix
of new
medicines of
great interest to the pharmaceutical industry and important contributions to the
knowledge of medicinal properties present in biodiversity
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/13174 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Bezerra, Rômulo José Soares |
| Contributors | Martins, Marco Aurélio, Persechini, Pedro Muanis, Santos, Eduardo Caio Torres dos, Silva, Patrícia Machado Rodrigues e, Almeida, Vinícius Cotta de, Alves, Luiz Anastacio, Frutuoso, Valber da Silva |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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