O sorgo é uma planta monocotiledônea diplóide com ciclo de vida de aproximadamente quatro meses. Apresenta grande relevância na agricultura pela sua utilização tanto para a alimentação humana e de animais quanto para a produção de biocombustíveis. Recentemente, o sorgo também surge como um forte candidato como planta modelo em estudos genômicos e fisiológicos relacionados com parede celular de gramíneas C4. Porém, para a análise da função de genes nesta espécie é essencial o estabelecimento da tecnologia de transformação genética que por sua vez depende de um eficiente método de regeneração de plantas. Nesse contexto, este trabalho teve como objetivo estabelecer um protocolo de cultura de tecidos utilizando discos de folhas e embriões imaturos como explantes, de modo a avaliar a redução do nível de oxidação na cultura in vitro pelo uso de antioxidantes e determinar as concentrações de reguladores vegetais para indução de embriogênese somática e regeneração de plantas. Em discos de folhas, os antioxidantes, PVP, ácido ascórbico e ác. cítrico foram testados na manipulação dos explantes até a inoculação em meio de cultura, porém não houve redução no nível de oxidação. Foram testados diferentes concentrações de 2,4-D para indução de calos e o uso de 1 mg L-1 e 2 mg L-1 apresentaram melhores respostas em embriogênese somática. Diferentes meios de cultura foram testados para obtenção de regeneração de plantas, mas a eficiência chegou somente a 1% de plantas a partir de discos de folhas. Em embriões imaturos, além dos antioxidantes PVP e ácido ascórbico, foram testados também os aminoácidos asparagina e prolina em meio de indução de calos. O uso de 2 g L-1 de asparagina e 3 g L-1 de prolina no meio de indução de calos e 3 mg L-1 de TDZ no meio de regeneração de plantas aumentou a eficiência de obtenção de plantas para até 15%. Assim, o uso de embriões imaturos foi considerado o explante mais promissor para a cultura de tecidos de sorgo. Devido aos altos níveis de oxidação e a baixa eficiência de regeneração de plantas em cultura de tecidos, foi testado o método de transformação genética via Agrobacterium tumefaciens conhecido como \"Floral dip\". Esta técnica não necessita da etapa de regeneração de plantas in vitro. Inicialmente, resultados promissores foram obtidos, porém há a necessidade do aprimoramento da metodologia. / Sorghum is a diploid monocot plant with a short life cycle of about 4 months. This crop is important in agriculture because it can be used for animal and human feed, and as well as source of raw material for biofuel production. Recently, sorghum also emerges as a strong candidate being a model plant on genomic and physiological studies related to cell wall in C4 grasses. Nevertheless, an efficient plant regeneration method is required for the establishment of genetic transformation technique to conduct the characterization of functional genes. In this context, the objective of this work was to establish a tissue culture protocol to evaluate the oxidation level of in vitro culture using leaf discs and immature embryos as explants, and testing different antioxidants and hormones concentrations for somatic embryogenesis and plant regeneration. In leaf discs, PVP, ascorbic acid and citric acid antioxidants were tested when manipulating the explants until their inoculation in culture media, but these factors failed to show any reduction in oxidation. In order to obtain somatic embryogenesis different concentrations of 2,4-D were tested for callus induction, 1,0 and 2,0 mg L-1 showed the best results. Several plant regeneration medium were tested however, only up to 1% of regeneration was achieved using leaf discs. In immature embryos, besides PVP and ascorbic acid antioxidants also asparagine and proline amino acids were tested in the callus induction media. The use of 2 g L-1 asparagine and 3 g L-1 proline in callus induction media and 3 mg L-1 TDZ in the regeneration media improved shoot regeneration efficiency up to 15%. Thus, the use of immature embryos was considered as a better option as explant for tissue culture of sorghum. Due to high production of oxidation and low frequency of plant regeneration in tissue culture, the genetic transformation via Agrobacterium tumefaciens known as \"Floral Dip\" method was tested. This technique does not require in vitro plant regeneration. Preliminary results were obtained, but the methodology needs to be improved.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-11112014-155455 |
| Date | 10 October 2014 |
| Creators | Hosaka, Guilherme Kenichi |
| Contributors | Carrer, Helaine |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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