Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2018. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAP-DF). / CAPÍTULO I: Neste trabalho, foi estudada uma família na qual 3 irmãs apresentaram amenorréia primária por provável alteração na formação dos ductos de Müller (DMs), caracterizada por hipoplasia uterina, endométrio não responsivo a estrógenos e gestações tubárias. Através de sequenciamento exômico amplo seguido por análise genética abrangente foi identificado uma mutação em homozigose no gene Odd-skipped related 1 gene (OSR1), p.V108F. Para esclarecer os efeitos do Osr1 no desenvolvimento dos DMs, foram investigados o padrão de expressão pré-natal e pós-natal de Osr1/Osr1 nos DMs e endométrio, respectivamente, e se a deleção de Osr1 poderia afetar o desenvolvimento dos DMs, através do uso de camundongos geneticamente modificados. Foi demonstrado que o Osr1 é expresso nos DMs e nos ductos de Wolff (DWs) de embriões com 13,5 dias de gestação (E13,5). Curiosamente, os DMs não foram observados no lado esquerdo e estavam truncados rostralmente no lado direito de E13,5 Osr1 -/- nocautes. Após o nascimento, o Osr1 é expresso no útero de camundongos selvagens ao longo de todo o desenvolvimento, com expressão mais acentuada em dois períodos distintos, aos 14 dias pós natais (PND14) e PND28-PND35, que correspondem à adenogênese endometrial e o início da puberdade, respectivamente. No útero adulto, a proteína Osr1 é expressa principalmente nas células epiteliais luminais e glandulares do endométrio, como também no epitélio dos ovidutos, sendo observada menor expressão no estroma endometrial. Através de uma abordagem translacional, demonstramos que OSR1 é um novo candidato entre os fatores moleculares que modulam a formação e diferenciação de estruturas derivadas dos DMs. CAPÍTULO II: No presente estudo, foram investigados comparativamente o padrão de expressão de Mkrn3 no hipotálamo com as gônadas masculinas e femininas. Além disso, foram abordados o padrão de expressão temporo-espacial desta proteína durante o desenvolvimento sexual, e se ela é regulada nos compartimentos testiculares pelas gonadotrofinas. A quantificação por qPCR mostrou que os níveis de mRNA de Mkrn3 foram detectados em testículos e ovários de camundongos selvagens em todas as idades avaliadas, entretanto, o padrão de expressão de Mkrn3 foi dimórfico entre gônadas masculinas e femininas ao longo da vida. Curiosamente, a expressão de Mkrn3 foi maior entre PND28 e PND35 nos testículos, enquanto que nos ovários atingiu os menores níveis durante o mesmo período. Adicionalmente, a coloração de X-gal em cortes de testículos provenientes de camundongos Mkrn3-LacZ adultos mostrou que o Mkrn3 é principalmente localizado no compartimento intersticial, especificamente em células de Leydig, mas também foi detectado nos túbulos seminíferos com menor expressão. Estudos in vitro e in vivo demonstraram que o RNAm de Mkrn3 aumentou em culturas primárias de células de Leydig tratadas com hCG. Além disso, a administração aguda de agonista de GnRH em camundongos selvagens adultos aumentou a expressão de Mkrn3 nos testículos, enquanto a inibição do eixo HPG pela mesma substância administrada de forma crônica levou ao efeito oposto. Por fim, no grupo de animais que receberam injeção de hCG após a inibição do eixo HPG, foi observado aumento na expressão de Mkrn3. Em conjunto, análises de expressão durante o desenvolvimento e estudos in vitro e in vivo mostraram que o Mkrn3 é produzido nos testículos, predominantemente nas células de Leydig, e que sua expressão de RNAm aumenta após a puberdade e é responsiva à ativação do receptor LH/hCG. / CHAPTER I: We present a family in which three sisters had a Mullerian Duct (MD) anomaly characterized by uterine hypoplasia, estrogen-unresponsive endometrium, primary amenorrhea, but spontaneous tubal pregnancies. Whole Exome Sequencing followed by comprehensive genetic analysis identified a novel homozygous variant in Odd-skipped related 1 gene (OSR1), p.V108F. To clarify the effects of Osr1 on MD development, we investigated prenatal and postnatal expression patterns of Osr1/Osr1 in the MDs and endometrium, respectively, and whether Osr1 deletion affects MD development, using genetically engineered mice. We showed that Osr1 is expressed in the MDs and Wolffian ducts (WDs) of E13.5 embryos. Interestingly, MDs are absent on the left side, and rostrally truncated on the right side of E13.5 Osr1-/-knockouts. Osr1 is expressed lifelong in WT mice uterus with two distinct peaks at PND14 and PND28-PND35, which correspond to endometrial adenogenesis and puberty initiation, respectively. Osr1 is expressed mainly in endometrial luminal and glandular epithelial cells, and less in stroma, with a high expression in oviduct epithelium. This pair-rule gene plays critical roles on embryonic patterning and tissue morphogenesis. Through a translational approach, we demonstrated that OSR1 is a novel candidate among the molecular factors that modulate the formation and differentiation of MD-derived structures.CHAPTER II: In the present study, we comparatively investigated the behavior of Mkrn3 expression in the hypothalamus versus male and female gonads. We also addressed the temporo-spatial expression pattern of this protein during sexual development, and whether it is regulated in the functional testicular compartments by gonadotropins. Quantification by qPCR showed that Mkrn3 mRNA levels was detected in testes and ovaries of wild-type mice at all ages evaluated, however, the pattern of Mkrn3 expression across lifespan differed between male and female gonads. Interestingly, Mkrn3 expression was highest by PN28 to PN35 in the testes, whereas it reached the nadir at the same postnatal ages in the ovaries. Moreover, X-gal staining of testes sections from adult Mkrn3-LacZ reporter mice showed that Mkrn3 is expressed mainly in the interstitial compartment, specifically in Leydig cells, but was also mildly detected in the seminiferous tubules. In vitro and in vivo studies demonstrated that the Mkrn3 mRNA levels increased in hCG-treated Leydig cells primary cultures. Furthermore, the acute administration of LHRH agonist in adult wild-type mice increased Mkrn3 expression in testes and the inhibition of the HPG axis, by chronic administration of LHRH agonist, leads to the opposite effect. Finally, the rescue of Mkrn3 expression was observed in the group of animals that received hCG injection after completing the HPG downregulation phase. Taken together, our developmental expression analyses, in vitro and in vivo studies showed that Mkrn3 is produced in the testis, predominantly in the Leydig cells, and that its mRNA expression increases after puberty and is responsive to LH/hCG receptor activation.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/34219 |
| Date | 17 August 2018 |
| Creators | Pereira, Sidney Alcântara |
| Contributors | Coelho, Michella Soares, Porto, Adriana Lofrano Alves |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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