Orientador: Eneida de Paula / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-25T21:39:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1
Fraceto_LeonardoFernandes_M.pdf: 7469454 bytes, checksum: b014b855ba92e32ce3588d2143839c61 (MD5)
Previous issue date: 2000 / Resumo: Várias teorias sobre o mecanismo de ação de anestésicos locais (AL) são descritas na literatura. Podemos destacar as que tentam explicar os efeitos diretos dos AL sobre a proteína canal de sódio e as que levam em conta a interação dos mesmos com a fase lipídica membranar. Também é bastante conhecida a correlação direta entre a hidrofobicidade das moléculas dos AL e sua potência anestésica clínica. Desta forma é muito razoável pensar que, no mecanismo de ação dos AL, a interação destes compostos anfifilicos com a membrana seja de fundamental importância e também que os AL, em sua forma neutra (não carregada), teriam um papel especial visto que apresentam maior afinidade pela fase lipídica, em relação à forma protonada. Neste trabalho, visando um melhor entendimento da interação AL com a fase membranar, escolhemos estudar a forma neutra de quatro anestésicos da família das aminoamidas (lidocaína, etidocaína, mepivacaína e bupivacaína) em lipossomos unilamelares de fosfatidilcolina de ovo (EPC). A escolha se deu pelo fato destes AL serem bastantes utilizados na clínica e por existirem poucos estudos envolvendo a forma neutra destes em sistemas membranares. Embora pertencentesa uma série homóloga estes AL apresentam propriedades químicas (hidrofobicidade) e estéricas (cíclicos vs não-cíclicos) bem diferentes. Utilizamos várias técnicas espectroscópicas: Ressonância Paramagnética Eletrônica (RPE), Fluorescência, Inftavermelho e Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de hidrogênio e fósforo para obtermos informações específicas sobre a interação AL e membrana. Nos experimentos de RPE e fluorescência sondas membranares em diferentes profundidades da cadeia acila foram úteis para evidenciar que a membrana lipídica se desorganiza quando incorporamos os quatro anestésicos, mas com variações quantitativas que refletem a localização preferencial de cada AL no interior das bicamadas. As medidas de inITavermelho e RMN de fósforo mostraram que a partição dos AL na membrana causa maior acesso de moléculas de água à região do grupo fosfato e glicerol dos lipídios, compátivel com a desorganização da membrana causada pelos AL e com o espaçamento lateral criado pela inserção dos mesmos entre as moléculas lipídicas. Utilizando a técnica de RMN de hidrogênio, verificamos que os AL particionam no interior das bicamadas, como observado pelo alargamento dos sinais dos picos dos hidrogênios dos AL quando em membrana, indicando uma menor mobilidade destes, em relação ao meio aquoso. Medidas do tempo de relaxação longitudinal (TI) mostraram-se de grande importância na investigação da localização preferencial dos AL, onde alterações nos hidrogênios de regiões mais profundas da bicamada foram detectados somente para os AL mais hidrofóbicos (etidocaína e bupivacaína). Medidas do efeito nuclear Overhauser (ROESY), revelaram "cross-peaks" intermoleculares (AL:lipídio) compatíveis com uma localização preferencial desses AL. Considerando que os AL atravessam rapidamente a bicamada e que sua localização no interior desta é melhor representada por uma função de distribuição (em relação à normal da bicamada), apresentamos aqui evidências de regiões de maior probabilidade de distribuição, isto é, onde os AL se encontrariam na maior parte do tempo. Um modelo de localização é apresentado para cada anestésico. Desta forma, pudemos demostrar que os anestésicos particionam em vesículas unilamelares de EPC causando maior desorganização que em lipossomos multilamelares, estudados anteriormente. A perturbação da membrana não é proporcional à hidrofobicidade dos compostos, nem mesmo quando presentes na mesma razão molar, AL:lipídio, na membrana. Os AL apresentam uma região preferencial de inserção no interior da bicamada lipídica, de acordo com suas propriedades químicas, ou seja, os mais hidrofóbicos (etidocaína e bupivacaína) se inserem mais profundamente que os hidrofilicos (lidocaína e mepivacaína), cujos anéis aromáticos se encaixariam na região do glicerol. A inserção em regiões mais profundas da bicam_da aumentaria a potência anestésica por facilitar o acesso dessas moléculas a sítios hidrofóbicos, no canal de sódio voltagem-dependente / Abstract: Literature carries many theories about the mechanism of action of local anesthetics (LA). We can highlight those that focus on the direct effect of LA on the sodium channel protein and the ones that consider the interaction of anesthetic molecules with the lipid membrane phase. The direct correlation between LA hydrophobicity and anesthetic potency is well known. So, it is reasonable to consider that the interaction of these amphiphilic compounds with the membrane could be of great importance, as well as the neutral (uncharged) forro interactio_ since its affinity for the membrane is higher than the protonated LA species. To better understand the LA - lipid membrane phase interactio_ we have chosen to study the neutral forro of four amino-amide local anesthetics (lidocaine, etidocaine, mepivacaine and bupivacaine) in unilamellar liposomes of phosphatidylcholine (EPC). The choice was made because these LA are clinically used and there are just a few studies involving the neutral species in membrane systems. These anesthetics belong to a homologous series but show quite different physicochemical properties such as hydrophobicity and steric parameters (mainly the cyclic vs. the non-cyclic). We have employed different spectroscopic techniques such as Electron Paramagnetic Resonance (EPR), Fluorescence, Infta-Red and Nuclear Magnetic Resonance (NMR) of hydrogen and phosphorus to obtain information about the specific interaction of LA with the membrane. In EPR and fluorescence measurements membrane probes inserted to different depths of the lipid acyl chain revealed that ali the four anesthetics led to a decrease in membrane organizatio_ but with quantitative differences related to the preferential positioning of each molecule inside the bilayer. IR and phosphorus-NMR measurements have clearly shown that partition of the LA molecule favors the access of water molecules up to the phosphate and glycerol moieties. These results are quite compatible with the decrease in membrane organization and can be explained by the spacement created by the LA insertion in-between the lipid molecules. Hydrogen NMR eH-NMR) techniques evidenced LA partition inside the membrane, as shown by the broadening of the anesthetics lH peaks when they move from the water to the membrane phase. Longitudinal relaxation time (TI) measurements were quite useful in the investigation of the preferential positioning of LA in the bilayer: just the more hydrophobic anesthetics (etidocaine and bupivacaine) were able to disturb the mobility of lipid hydrogens in the acyl chain core region. Nuclear Overhauser effect (ROESY) experiments revealed LA:lipid cross-peaks consistent with the preferential insertion of these molecules. Considering that LA crosses the membranes in a fast way and that its location inside the bilayer is best represented by a distribution function (against the bilayer normal), we have brought together clear evidences of regions with greater probabilities of finding the LA, i.e., where the LA stay most of the time. A model for the LA location inside the bilayer is presented. We show here that local anesthetics partition causes a greater change in membrane organization in unilamellar than in multilamellar EPC vesicles, previously studied in our laboratory. Membrane perturbation is not proportional to the LA hydrophobicity, even when equal LA:lipid molar ratios are present inside the membrane. Each LA seems to have a preferential positioning inside the bilayer, determined by its chemical properties, i.e., the more hydrophobic (etidocaine and bupivacaine) prefer deeper regions than the more hydrophilic (lidocaine and mepivacaine), which aromatic rings would lye in the glycerol moiety. We believe that the deeper insertion would favor anesthetic potency by facilitating the access ofthe molecule to hydrophobic sites ofthe sodium channel protein / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unicamp.br:REPOSIP/314157 |
| Date | 28 March 2000 |
| Creators | Fraceto, Leonardo Fernandes |
| Contributors | UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS, Paula, Eneida de, 1963-, Santana, Maria Helena Andrade, Fujiwara, Fred Yukio |
| Publisher | [s.n.], Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | 111p. : il., application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da Unicamp, instname:Universidade Estadual de Campinas, instacron:UNICAMP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0023 seconds