Tnt1 foi o primeiro retrotransposon ativo identificado em fumo após sua inserção no gene estrutural da nitrato redutase. Dez anos mais tarde, um novo membro foi caracterizado em Lycopersicon: Retrolyc1. Neste estudo analisamos seqüências similares a Tnt1 em 20 espécies silvestres de Solanum e cinco cultivares de Solanum tuberosum. As seqüências completas foram amplificadas a partir de DNA genômico utilizando uma estratégia baseada em PCR. Os fragmentos purificados foram clonados e seqüenciados, e a análise filogenética revelou três grupos que diferem na sua região U3 [Genbank: EF620567-EF620763]. Estes fragmentos clonados foram chamados de Retrosol. Utilizando uma abordagem de \"network\" com um total de 453 seqüências não redundantes e isoladas de espécies de: Solanum (197), Nicotiana (140) e (116) Lycopersicon, foi demonstrado que a família Tnt1 pode ser tratada como uma população para tentar resolver ramificações filogenéticas multiforcadas. A rede resultante da RNAseH revelou que as seqüências agrupam de acordo com o gênero de Solanaceae, sustentando uma forte associação com o genoma hospedeiro, e que a variação das seqüências na região U3 associada, caracteriza o padrão evolutivo modular dentro da família Tnt1. Dentro de cada gênero, e independentemente das espécies, quase 20% das seqüências Tnt1 analisadas são idênticas, o que indica que foram provenientes de uma cópia ativa. As relações de \"network\" permitiram a identificação da \"seqüência mestre ou fundadora\" e forneceu provas de que dentro de cada gênero essas seqüências mestre são associadas com regiões U3 distintas. O número de cópias de seqüências similares a Tnt1 foi determinado utilizando PCR quantitativo em tempo-real. Comparando-se o número de cópias, foi revelado que em fumo as cópias de Tnt1 são abundantes e representam cerca de 2% do genoma, enquanto em tomate as cópias de Retrolyc1 são menos abundantes. As espécies de Solanum mostraram um número baixo de cópias de Retrosol e uma relação LTR: domínio interno de aproximadamente 2:1, sugerindo que a maioria das cópias são completas. Utilizando uma estratégia baseada em PCR, uma seqüência completa de Retrosol de quase 5 kb foi clonada. Esta cópia possui todas as características típicas de um retrotransposon tipo Ty1-copia e apresenta baixa identidade de nucleotídeos na região U3 quando comparada, aos outros membros da família. Os resultados aqui apresentados corroboram a hipótese de que a família Tnt1 estava presente logo no início da evolução de Solanaceae. A evidência sugere também que a região da RNAseH ficou fixada ao nível de gênero no hospedeiro, e que dentro de cada gênero a propagação foi assegurado pela diversificação da região U3. / Tnt1 was the first active plant retrotransposon identified in tobacco after nitrate reductase gene disruption. Ten years later a new member was characterized in Lycopersicon: Retrolyc1. In this study, we performed an analysis of Tnt1-like sequences of 20 wild species of Solanum and five cultivars of Solanum tuberosum. Sequences were amplified from total genomic DNA using a PCR-based approach. Purified fragments were cloned and sequenced, and clustering analysis revealed three groups that differ in their U3 region [GenBank: EF620567-EF620763]. These cloned fragments were named Retrosol. Using a network approach with a total of 453 non-redundant sequences isolated from Solanum (197), Nicotiana (140) and Lycopersicon (116) species, it was demonstrated that the Tnt1 family can be treated as a population to resolve previous phylogenetic multifurcations. The resulting RNAseH network revealed that sequences group according to the Solanaceae genus, supporting a strong association with the host genome, whereas tracing the U3 region sequence association characterizes the modular evolutionary pattern within the Tnt1 family. Within each genus, and irrespective of species, nearly 20% of Tnt1 sequences analyzed are identical, indicative of being part of an active copy. The network approach enabled the identification of putative \"master\" sequences and provided evidence that within a genus these master sequences are associated with distinct U3 regions. Copy number of Tnt1-like sequences was determined using quantitative real-time PCR. Comparing copy number among the species revealed that Tnt1 elements are abundant in tobacco, representing around 2% of the genome while Retrolyc1 elements in tomato are less abundant. Solanum species show low copy number of Retrosol elements and an LTR:internal domain ratio of about 2:1, indicating that most copies are complete. A complete sequence of Retrosol, which is nearly 5 kb long was cloned using a PCR approach. It has all the features typical of a Ty1-copia like retrotransposon and show low nucleotide identity in the U3 region when compared with the other members of the family. The results presented here support the hypothesis that the Tnt1 family was present early in the evolution of Solanaceae. The evidence also suggests that the RNAseH region of Tnt1 became fixed at the host genus level whereas, within each genus, propagation was ensured by the diversification of the U3 region.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-30012008-094441 |
| Date | 04 December 2007 |
| Creators | Maria Elisa Manetti |
| Contributors | Marie Anne van Sluys, Celso Luis Marino, Antonio Salatino, Glaucia Mendes Souza, Armando Morais Ventura |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Ciências Biológicas (Botânica), USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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