Elementos de transposição são sequências de DNA que possuem a habilidade de se transpor. Estes elementos são divididos em dois grupos de acordo com seu mecanismo de transposição. Aqueles que se transpõem diretamente a partir de moléculas de DNA são chamados de transposons e os que se transpõem através de um intermediário de RNA são chamados de retrotransposons. Os retrotransposons são encontrados nos mais diversos organismos e sua atividade é altamente regulada pelos seus hospedeiros, uma vez que no processo de transposição, efeitos deletérios decorrentes da inserção/inativação de genes podem resultar em eventos drásticos para o organismo. Foram descritos dois mecanismos de controle desses elementos. O primeiro consiste na inativação da transcrição do elemento (inibição transcricional), e o segundo consiste na degradação do mRNA pelo sistema de interferência de RNA (Inibição pós-transcricional). Apesar de serem regulados negativamente, foi verificado em plantas de fumo a indução da expressão do retrotransposon Tnt1 em situações de estresse como em injúrias e processo de regeneração. De forma geral a ativação destes é bastante intrigante e durante diversos anos estes elementos foram considerados “DNA lixo" ou “DNA egoísta". O presente trabalho procurou avaliar a função destes elementos na regeneração de plantas de fumo através de sua inibição nessa fase. A inibição foi realizada através de construções que induzem o sistema de inteferência de RNA, clivando o mRNA dos elementos provindos de qualquer cópia no genoma. Foram selecionados indivíduos geneticamente modificados que apresentaram deficiência de desenvolvimento, ausência de raízes e resposta de hipersensibilidade. / Transposable elements are DNA sequences that have the ability of transposition. These elements are divided in two groups according to their transposition mechanism. Those that transpose directly as a DNA molecule are called transposons and those that are dependent on a RNA intermediate are called retrotransposons. Retrotransposons are found in various organisms and are highly regulated by their hosts. In many cases of transposition, the retroelements may be inserted into other genes, causing deleterious effects and damages to the organism. Two control mechanisms have been described in previous studies. One consists of the element transcription inactivation (transcriptional inhibition), and the second consists of the mRNA degradation by the RNA interference system (post-transcriptional inhibition). Despite the negative regulation of these elements, the induction of expression of Tnt1 retrotransposon was described in tobacco plants under stress situations such as injuries and regeneration. The function of the retroelements, in general, is not yet known although they are usually considered as “junk DNA" or “selfish genes". Therefore, studies on the inactivation of these elements are particularly interesting. In this work, the function of these elements in tobacco plants was studied by the use of RNAi methods and analysis during the regeneration phase and plant development were evaluated. Phenotypes are described which are related to previous expression studies supporting a specific role for these elements not yet described.

Elementos de transposição são sequências de DNA que possuem a habilidade de se transpor. Estes elementos são divididos em dois grupos de acordo com seu mecanismo de transposição. Aqueles que se transpõem diretamente a partir de moléculas de DNA são chamados de transposons e os que se transpõem através de um intermediário de RNA são chamados de retrotransposons. Os retrotransposons são encontrados nos mais diversos organismos e sua atividade é altamente regulada pelos seus hospedeiros, uma vez que no processo de transposição, efeitos deletérios decorrentes da inserção/inativação de genes podem resultar em eventos drásticos para o organismo. Foram descritos dois mecanismos de controle desses elementos. O primeiro consiste na inativação da transcrição do elemento (inibição transcricional), e o segundo consiste na degradação do mRNA pelo sistema de interferência de RNA (Inibição pós-transcricional). Apesar de serem regulados negativamente, foi verificado em plantas de fumo a indução da expressão do retrotransposon Tnt1 em situações de estresse como em injúrias e processo de regeneração. De forma geral a ativação destes é bastante intrigante e durante diversos anos estes elementos foram considerados “DNA lixo” ou “DNA egoísta”. O presente trabalho procurou avaliar a função destes elementos na regeneração de plantas de fumo através de sua inibição nessa fase. A inibição foi realizada através de construções que induzem o sistema de inteferência de RNA, clivando o mRNA dos elementos provindos de qualquer cópia no genoma. Foram selecionados indivíduos geneticamente modificados que apresentaram deficiência de desenvolvimento, ausência de raízes e resposta de hipersensibilidade. / Transposable elements are DNA sequences that have the ability of transposition. These elements are divided in two groups according to their transposition mechanism. Those that transpose directly as a DNA molecule are called transposons and those that are dependent on a RNA intermediate are called retrotransposons. Retrotransposons are found in various organisms and are highly regulated by their hosts. In many cases of transposition, the retroelements may be inserted into other genes, causing deleterious effects and damages to the organism. Two control mechanisms have been described in previous studies. One consists of the element transcription inactivation (transcriptional inhibition), and the second consists of the mRNA degradation by the RNA interference system (post-transcriptional inhibition). Despite the negative regulation of these elements, the induction of expression of Tnt1 retrotransposon was described in tobacco plants under stress situations such as injuries and regeneration. The function of the retroelements, in general, is not yet known although they are usually considered as “junk DNA” or “selfish genes”. Therefore, studies on the inactivation of these elements are particularly interesting. In this work, the function of these elements in tobacco plants was studied by the use of RNAi methods and analysis during the regeneration phase and plant development were evaluated. Phenotypes are described which are related to previous expression studies supporting a specific role for these elements not yet described.

Tnt1 foi o primeiro retrotransposon ativo identificado em fumo após sua inserção no gene estrutural da nitrato redutase. Dez anos mais tarde, um novo membro foi caracterizado em Lycopersicon: Retrolyc1. Neste estudo analisamos seqüências similares a Tnt1 em 20 espécies silvestres de Solanum e cinco cultivares de Solanum tuberosum. As seqüências completas foram amplificadas a partir de DNA genômico utilizando uma estratégia baseada em PCR. Os fragmentos purificados foram clonados e seqüenciados, e a análise filogenética revelou três grupos que diferem na sua região U3 [Genbank: EF620567-EF620763]. Estes fragmentos clonados foram chamados de Retrosol. Utilizando uma abordagem de \"network\" com um total de 453 seqüências não redundantes e isoladas de espécies de: Solanum (197), Nicotiana (140) e (116) Lycopersicon, foi demonstrado que a família Tnt1 pode ser tratada como uma população para tentar resolver ramificações filogenéticas multiforcadas. A rede resultante da RNAseH revelou que as seqüências agrupam de acordo com o gênero de Solanaceae, sustentando uma forte associação com o genoma hospedeiro, e que a variação das seqüências na região U3 associada, caracteriza o padrão evolutivo modular dentro da família Tnt1. Dentro de cada gênero, e independentemente das espécies, quase 20% das seqüências Tnt1 analisadas são idênticas, o que indica que foram provenientes de uma cópia ativa. As relações de \"network\" permitiram a identificação da \"seqüência mestre ou fundadora\" e forneceu provas de que dentro de cada gênero essas seqüências mestre são associadas com regiões U3 distintas. O número de cópias de seqüências similares a Tnt1 foi determinado utilizando PCR quantitativo em tempo-real. Comparando-se o número de cópias, foi revelado que em fumo as cópias de Tnt1 são abundantes e representam cerca de 2% do genoma, enquanto em tomate as cópias de Retrolyc1 são menos abundantes. As espécies de Solanum mostraram um número baixo de cópias de Retrosol e uma relação LTR: domínio interno de aproximadamente 2:1, sugerindo que a maioria das cópias são completas. Utilizando uma estratégia baseada em PCR, uma seqüência completa de Retrosol de quase 5 kb foi clonada. Esta cópia possui todas as características típicas de um retrotransposon tipo Ty1-copia e apresenta baixa identidade de nucleotídeos na região U3 quando comparada, aos outros membros da família. Os resultados aqui apresentados corroboram a hipótese de que a família Tnt1 estava presente logo no início da evolução de Solanaceae. A evidência sugere também que a região da RNAseH ficou fixada ao nível de gênero no hospedeiro, e que dentro de cada gênero a propagação foi assegurado pela diversificação da região U3. / Tnt1 was the first active plant retrotransposon identified in tobacco after nitrate reductase gene disruption. Ten years later a new member was characterized in Lycopersicon: Retrolyc1. In this study, we performed an analysis of Tnt1-like sequences of 20 wild species of Solanum and five cultivars of Solanum tuberosum. Sequences were amplified from total genomic DNA using a PCR-based approach. Purified fragments were cloned and sequenced, and clustering analysis revealed three groups that differ in their U3 region [GenBank: EF620567-EF620763]. These cloned fragments were named Retrosol. Using a network approach with a total of 453 non-redundant sequences isolated from Solanum (197), Nicotiana (140) and Lycopersicon (116) species, it was demonstrated that the Tnt1 family can be treated as a population to resolve previous phylogenetic multifurcations. The resulting RNAseH network revealed that sequences group according to the Solanaceae genus, supporting a strong association with the host genome, whereas tracing the U3 region sequence association characterizes the modular evolutionary pattern within the Tnt1 family. Within each genus, and irrespective of species, nearly 20% of Tnt1 sequences analyzed are identical, indicative of being part of an active copy. The network approach enabled the identification of putative \"master\" sequences and provided evidence that within a genus these master sequences are associated with distinct U3 regions. Copy number of Tnt1-like sequences was determined using quantitative real-time PCR. Comparing copy number among the species revealed that Tnt1 elements are abundant in tobacco, representing around 2% of the genome while Retrolyc1 elements in tomato are less abundant. Solanum species show low copy number of Retrosol elements and an LTR:internal domain ratio of about 2:1, indicating that most copies are complete. A complete sequence of Retrosol, which is nearly 5 kb long was cloned using a PCR approach. It has all the features typical of a Ty1-copia like retrotransposon and show low nucleotide identity in the U3 region when compared with the other members of the family. The results presented here support the hypothesis that the Tnt1 family was present early in the evolution of Solanaceae. The evidence also suggests that the RNAseH region of Tnt1 became fixed at the host genus level whereas, within each genus, propagation was ensured by the diversification of the U3 region.

Tnt1 foi o primeiro retrotransposon ativo identificado em fumo após sua inserção no gene estrutural da nitrato redutase. Dez anos mais tarde, um novo membro foi caracterizado em Lycopersicon: Retrolyc1. Neste estudo analisamos seqüências similares a Tnt1 em 20 espécies silvestres de Solanum e cinco cultivares de Solanum tuberosum. As seqüências completas foram amplificadas a partir de DNA genômico utilizando uma estratégia baseada em PCR. Os fragmentos purificados foram clonados e seqüenciados, e a análise filogenética revelou três grupos que diferem na sua região U3 [Genbank: EF620567-EF620763]. Estes fragmentos clonados foram chamados de Retrosol. Utilizando uma abordagem de \"network\" com um total de 453 seqüências não redundantes e isoladas de espécies de: Solanum (197), Nicotiana (140) e (116) Lycopersicon, foi demonstrado que a família Tnt1 pode ser tratada como uma população para tentar resolver ramificações filogenéticas multiforcadas. A rede resultante da RNAseH revelou que as seqüências agrupam de acordo com o gênero de Solanaceae, sustentando uma forte associação com o genoma hospedeiro, e que a variação das seqüências na região U3 associada, caracteriza o padrão evolutivo modular dentro da família Tnt1. Dentro de cada gênero, e independentemente das espécies, quase 20% das seqüências Tnt1 analisadas são idênticas, o que indica que foram provenientes de uma cópia ativa. As relações de \"network\" permitiram a identificação da \"seqüência mestre ou fundadora\" e forneceu provas de que dentro de cada gênero essas seqüências mestre são associadas com regiões U3 distintas. O número de cópias de seqüências similares a Tnt1 foi determinado utilizando PCR quantitativo em tempo-real. Comparando-se o número de cópias, foi revelado que em fumo as cópias de Tnt1 são abundantes e representam cerca de 2% do genoma, enquanto em tomate as cópias de Retrolyc1 são menos abundantes. As espécies de Solanum mostraram um número baixo de cópias de Retrosol e uma relação LTR: domínio interno de aproximadamente 2:1, sugerindo que a maioria das cópias são completas. Utilizando uma estratégia baseada em PCR, uma seqüência completa de Retrosol de quase 5 kb foi clonada. Esta cópia possui todas as características típicas de um retrotransposon tipo Ty1-copia e apresenta baixa identidade de nucleotídeos na região U3 quando comparada, aos outros membros da família. Os resultados aqui apresentados corroboram a hipótese de que a família Tnt1 estava presente logo no início da evolução de Solanaceae. A evidência sugere também que a região da RNAseH ficou fixada ao nível de gênero no hospedeiro, e que dentro de cada gênero a propagação foi assegurado pela diversificação da região U3. / Tnt1 was the first active plant retrotransposon identified in tobacco after nitrate reductase gene disruption. Ten years later a new member was characterized in Lycopersicon: Retrolyc1. In this study, we performed an analysis of Tnt1-like sequences of 20 wild species of Solanum and five cultivars of Solanum tuberosum. Sequences were amplified from total genomic DNA using a PCR-based approach. Purified fragments were cloned and sequenced, and clustering analysis revealed three groups that differ in their U3 region [GenBank: EF620567-EF620763]. These cloned fragments were named Retrosol. Using a network approach with a total of 453 non-redundant sequences isolated from Solanum (197), Nicotiana (140) and Lycopersicon (116) species, it was demonstrated that the Tnt1 family can be treated as a population to resolve previous phylogenetic multifurcations. The resulting RNAseH network revealed that sequences group according to the Solanaceae genus, supporting a strong association with the host genome, whereas tracing the U3 region sequence association characterizes the modular evolutionary pattern within the Tnt1 family. Within each genus, and irrespective of species, nearly 20% of Tnt1 sequences analyzed are identical, indicative of being part of an active copy. The network approach enabled the identification of putative \"master\" sequences and provided evidence that within a genus these master sequences are associated with distinct U3 regions. Copy number of Tnt1-like sequences was determined using quantitative real-time PCR. Comparing copy number among the species revealed that Tnt1 elements are abundant in tobacco, representing around 2% of the genome while Retrolyc1 elements in tomato are less abundant. Solanum species show low copy number of Retrosol elements and an LTR:internal domain ratio of about 2:1, indicating that most copies are complete. A complete sequence of Retrosol, which is nearly 5 kb long was cloned using a PCR approach. It has all the features typical of a Ty1-copia like retrotransposon and show low nucleotide identity in the U3 region when compared with the other members of the family. The results presented here support the hypothesis that the Tnt1 family was present early in the evolution of Solanaceae. The evidence also suggests that the RNAseH region of Tnt1 became fixed at the host genus level whereas, within each genus, propagation was ensured by the diversification of the U3 region.

Tnt1 is a transcriptionally active LTR-retrotransposon, present in over 600 copies in the Nicotiana tabacum genome. Under normal growth conditions, Tnt1 expression is limited to basal levels, but its expression is further induced under biotic and abiotic stresses. Transgenic tobacco plants (HP plants) expressing a Tnt1 reverse transcriptase hairpin were generated. These showed pleiotropic phenotypes such as cell death spots on the leaves and callose deposition and other severe abnormal development in aerial and underground portions. RNA sequencing of leaves with cell death spots revealed a rewiring of transcriptional regulatory networks related to stress responses exclusive to HPs. Among the positively modulated genes were ethylene synthesis and response cascade genes. The objective of the present work was to unravel the relation observed between Tnt1 and ethylene, generating a model. The results obtained suggest that HP seedlings and plants have increased ethylene synthesis when compared to the wildtype. Folding prediction of Tnt1 messenger RNA allowed the identification of ethylene-responsive sequences in putative stem loop locations. Thus it is possible that Tnt1 expression can produce small RNAs targeted to sequences present in the Tnt1 retrotransposon itself as well as at the promoter region of other ethylene responsive genes. Quantification of the expression of Tnt1 and ethylene related genes revealed \"phase opposition\" expression kinetics in the HPs, which led us to hypothesize that there might be an antagonistic relationship between the expression of Tnt1 and the expression of ethylene responsive genes involved in plant defense responses. Our findings suggest that Tnt1 could generate sRNAs that exerts transcriptional control over itself as well as other genes. Our model establishes a completely new biological role for a retrotransposon: Tnt1 would provide feedback control to ethylene-mediated gene regulation in tobacco defense responses, bringing the system back to a homeostatic condition and turning the defense responses down. / Tnt1 é um retrotransposon com LTR transcricionalmente ativo, e está presente em mais de 600 cópias no genoma de Nicotiana tabacum. Em condições normais de crescimento Tnt1 é expresso em níveis basais. No entanto, sua expressão é induzida pelo estímulo de estresses bióticos e abióticos. Plantas de tabaco transgênicas (chamadas de HP) expressando um grampo da transcriptase reversa de Tnt1 foram geradas. Estas apresentaram fenótipos como: pontos de morte celular e deposição de calose nas folhas e severas anomalias de desenvolvimento severas nas porções aérea e radicular das plantas. Sequenciamento de RNA de folhas com os pontos de morte celular revelou uma reorganização de redes de regulação transcricional relacionadas a resposta a estresses. Essas novas redes surgiram exclusivamente nas plantas HP. Entre os genes modulados positivamente estavam genes de síntese e de resposta ao etileno. O presente trabalho teve como objetivo elucidar a relação observada entre Tnt1 e o fitormônio etileno gerando um modelo de atuação. Os resultados obtidos permitiram demonstrar que plântulas e plantas HP adultas tem um aumento na síntese de etileno quando comparadas à selvagem. A predição do dobramento do RNA mensageiro de Tnt1 permitiu a identificação de sequências responsivas ao etileno localizadas em posição potencial para formar grampos. Desta forma, é possível que a expressão de Tnt1 leve à produção de pequenos RNAs que tem como alvo sequências responsivas a etileno presentes tanto no próprio elemento quanto em regiões promotoras de outros genes. A quantificação da expressão de Tnt1 versus genes relacionados ao etileno revelou um padrão em \"oposição de fase\" nas HPs, o que nos levou a hipotetizar que talvez ocorra uma relação antagonista entre a expressão de Tnt1 e a expressão de genes responsivos ao etileno envolvidos em respostas de defesa vegetais. Nossos resultados sugerem que Tnt1 pode gerar pequenos RNAs que exercem controle transcricional sobre Tnt1 e outros genes endógenos. Nosso modelo estabelece um novo papel biológico para um retrotransposon: Tnt1 agiria como um modulador da indução de genes mediada por etileno nas respostas de defesa de tabaco, trazendo o sistema de volta à condição homeostática e encerrando as respostas de defesa.

Tnt1 is a transcriptionally active LTR-retrotransposon, present in over 600 copies in the Nicotiana tabacum genome. Under normal growth conditions, Tnt1 expression is limited to basal levels, but its expression is further induced under biotic and abiotic stresses. Transgenic tobacco plants (HP plants) expressing a Tnt1 reverse transcriptase hairpin were generated. These showed pleiotropic phenotypes such as cell death spots on the leaves and callose deposition and other severe abnormal development in aerial and underground portions. RNA sequencing of leaves with cell death spots revealed a rewiring of transcriptional regulatory networks related to stress responses exclusive to HPs. Among the positively modulated genes were ethylene synthesis and response cascade genes. The objective of the present work was to unravel the relation observed between Tnt1 and ethylene, generating a model. The results obtained suggest that HP seedlings and plants have increased ethylene synthesis when compared to the wildtype. Folding prediction of Tnt1 messenger RNA allowed the identification of ethylene-responsive sequences in putative stem loop locations. Thus it is possible that Tnt1 expression can produce small RNAs targeted to sequences present in the Tnt1 retrotransposon itself as well as at the promoter region of other ethylene responsive genes. Quantification of the expression of Tnt1 and ethylene related genes revealed \"phase opposition\" expression kinetics in the HPs, which led us to hypothesize that there might be an antagonistic relationship between the expression of Tnt1 and the expression of ethylene responsive genes involved in plant defense responses. Our findings suggest that Tnt1 could generate sRNAs that exerts transcriptional control over itself as well as other genes. Our model establishes a completely new biological role for a retrotransposon: Tnt1 would provide feedback control to ethylene-mediated gene regulation in tobacco defense responses, bringing the system back to a homeostatic condition and turning the defense responses down. / Tnt1 é um retrotransposon com LTR transcricionalmente ativo, e está presente em mais de 600 cópias no genoma de Nicotiana tabacum. Em condições normais de crescimento Tnt1 é expresso em níveis basais. No entanto, sua expressão é induzida pelo estímulo de estresses bióticos e abióticos. Plantas de tabaco transgênicas (chamadas de HP) expressando um grampo da transcriptase reversa de Tnt1 foram geradas. Estas apresentaram fenótipos como: pontos de morte celular e deposição de calose nas folhas e severas anomalias de desenvolvimento severas nas porções aérea e radicular das plantas. Sequenciamento de RNA de folhas com os pontos de morte celular revelou uma reorganização de redes de regulação transcricional relacionadas a resposta a estresses. Essas novas redes surgiram exclusivamente nas plantas HP. Entre os genes modulados positivamente estavam genes de síntese e de resposta ao etileno. O presente trabalho teve como objetivo elucidar a relação observada entre Tnt1 e o fitormônio etileno gerando um modelo de atuação. Os resultados obtidos permitiram demonstrar que plântulas e plantas HP adultas tem um aumento na síntese de etileno quando comparadas à selvagem. A predição do dobramento do RNA mensageiro de Tnt1 permitiu a identificação de sequências responsivas ao etileno localizadas em posição potencial para formar grampos. Desta forma, é possível que a expressão de Tnt1 leve à produção de pequenos RNAs que tem como alvo sequências responsivas a etileno presentes tanto no próprio elemento quanto em regiões promotoras de outros genes. A quantificação da expressão de Tnt1 versus genes relacionados ao etileno revelou um padrão em \"oposição de fase\" nas HPs, o que nos levou a hipotetizar que talvez ocorra uma relação antagonista entre a expressão de Tnt1 e a expressão de genes responsivos ao etileno envolvidos em respostas de defesa vegetais. Nossos resultados sugerem que Tnt1 pode gerar pequenos RNAs que exercem controle transcricional sobre Tnt1 e outros genes endógenos. Nosso modelo estabelece um novo papel biológico para um retrotransposon: Tnt1 agiria como um modulador da indução de genes mediada por etileno nas respostas de defesa de tabaco, trazendo o sistema de volta à condição homeostática e encerrando as respostas de defesa.

In this dissertation I am using M. truncatula as a model legume that forms indeterminate nodules with rhizobia under limited nitrogen conditions. I take advantage of an M. truncatula Tnt1 mutant population that provides a useful resource to uncover and characterize novel genes. Here, I focused on several objectives. First, I carried out forward and reverse genetic screening of M. truncatula Tnt1 mutant populations to uncover novel genes involved in symbiotic nitrogen fixation. Second, I focused on reverse genetic screening of two genes, identified as encoding blue copper proteins, and characterization of their mutants' potential phenotypes. Third, I further characterized a nodule essential gene, M. truncatula vacuolar iron transporter like 8 (MtVTL8), which encodes a nodule specific iron transporter. I characterized the expression pattern, expression localization and function of MtVTL8. Additionally, I characterized several residues predicted to be essential to function using a model based on the known crystal structure of Eucalyptus grandis vacuolar iron transporter 1 (EgVIT1), a homologous protein to MtVTL8. I identified several potential essential residues of the MtVTL8 protein, mutagenized them, and through complementation experiments in planta and in yeast assessed functionality of the resulting protein. This helped us to better understand the potential mechanism by which MtVTL8 functions.

Legumes are unique plants because they form special structures “nodules”, via symbiotic relationships with rhizobial bacteria present in the soil. Once rhizobia mature inside nodules, they fix atmospheric nitrogen providing a source of bioavailable nitrogen to the plant. To discover novel genetic components involved in the legume-rhizobia symbiosis by using forward genetic screening, we have isolated Medicago truncatula Tnt1 insertion mutants in the R108 ecotype, which are defective in nodule development and symbiotic nitrogen fixation in response to Sinorhizobium meliloti. Out of three mutants NF11044, NF11217 and NF8324, one of the mutants showed brown nodules and Fix- phenotype that is defective in symbiotic nitrogen fixation. The other two mutants showed white nodules and Fix- phenotype, also indicator of defects in symbiotic nitrogen fixation. To identify the underlying mutation causing the phenotype, we have developed molecular genetic markers by obtaining genomic sequences flanking the Tnt1 insertions by TAIL-PCR and Illumina sequencing. To carry out co-segregation analysis, back-crossed BC1F2 segregating populations were obtained. These are being phenotyped, genotyped and analyzed for co-segregation of the phenotype with the Tnt1 genetic markers. Back-crossing also has the effect of reducing the Tnt1 insertions, which are not linked to the nodulation defective phenotypes. Out of the three mutants, NF8324 harbors exactly the same insertion as in the rsd-1 Tnt1 mutant NF11265. The defect in NF11217 is caused by a Tnt1 insertion in the previously described PLC gene; the site of this insertion is close to that found in a different mutant, NF0217. For mutant NF11044, we developed linkage markers that place the defective locus on chromosome 7. To further characterize co-segregation in NF11044, a mapping population has been created by crossing the mutant with other ecotypes: A17 and A20. We tested mutants and wild type plants with linkage marker A20 X NF11044 BC1F2 that segregates 3:1(wild type: mutant). The recombination frequency ratio is similar as compared to back-crosses to ecotype R108. However, we did not observe mutant phenotypes in the A17 X NF11044 BC1F2 population. Future identification of the defective gene and functional characterization of it once it is identified will be carried out to better understand the mechanism of nodule organogenesis and symbiotic nitrogen fixation.