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Previous issue date: 2008-05-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / High Performance Liquid Chromatography (HPLC) allows both qualitative and
quantitative chemical analysis, separating and identifying substances in mixtures with speed and
efficiency. However, factors governing chromatographic retention are complex and the method
development phase consumes a lot of resources. In our work we evaluated a chromatographic
simulation software package (HIPAC-G, HIPAC-B e HIPAC-S, Phenomenex, Torrance, USA) for
optimizing the chromatographic separation of eight flavonoid standards (3-O-[β-Dglucopyranosyl-(
1→6)-α-L-ramnopyranosyl]-7-O-α-L-ramnopyranosyl kampferol; hesperidine;
kampferol; tiliroside; quercetin; 3,4 ,7,8-tetra-O-methyl-gossypetine; 3,3 ,4 ,7,8-penta-O-methylgossypetine
and 3,3 ,4 ,7-tetra-O-methyl-quercetin). The HIPAC model of retention is based on
the known linear relationship that exists between the retention factor of an analyte and the
percentage of organic solvent in the mobile phase, to simulate retention data. Using gradient
elution, three trial runs were done (preliminary runs that are used to input retention data to the
software). The first trial run used a C18 column (250 x 4,6 mm, 5 m) and as mobile phase a
gradient from 5 to 95% of acetonitrile (solvent B) in 0,1% formic acid (solvent A) at a flow rate of
1 mL/min with UV detection at 264 nm. The first trial run was comprised of two gradient runs
using the same chromatographic conditions but different gradient duration times (30 and 60
minutes respectively). The second trial run used the same chromatographic conditions as the first
one, but methanol instead of acetonitrile as the organic modifier and 10% and 100% as the initial
and final %B, respectively. The third trial run was done with the same chromatographic
conditions as the second one, but using a column with different stationary phase and dimensions
(C8, 150 x 4,6 mm, 5 m). The retention data of the three trial runs were used as input to the
simulation software, using the HIPAC-G module. For isocratic mode simulation using the
HIPAC-B module, both a C8 (150 x 4,6 mm, 5 m) and a C18 (250 x 4,6 mm 5 m) column was
used with binary mixtures of MeOH (solvent B) in 0,1% formic acid (solvent A). Two trial runs
with 60% and 70%B were done for each column and the resulting retention data used as input for
simulation. The optimized separation conditions as suggested by HIPAC-B were used as input for
HIPAC-S to optimize the system chromatographic conditions. The optimization criterion used for
all simulations was the average global resolution for all peaks in the chromatogram. Altogether
twelve simulations in gradient elution mode and four isocratic simulations were done. The
simulated retention data was then confronted with experimentally obtained retention data for the
eight flavonoid standards. The correlation coefficient (r2) between simulated and observed
retention times for the analytes when eluted in gradient mode varied from 0,9416 to 0,9992
(n=12). The correlation coefficient in isocratic mode varied from 0.9999 to 1 (n=4), indicating an
excellent efficiency in predicting retention data for the mixture tested. Taken together our results
show that the use of chromatographic simulation software such as HIPAC-G, HIPAC-B e HIPACS
can constitute an important tool in the optimization of separation conditions of complex
mixtures, such as those found in the field of natural products. / A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) permite análises químicas
qualitativas e quantitativas, separando e identificando substâncias em misturas com rapidez e
eficiência. Entretanto, os fatores que governam a retenção cromatográfica são complexos e a fase
de desenvolvimento de métodos consome muitos recursos. Em nosso trabalho nós avaliamos um
pacote de softwares de simulação cromatográfica (HIPAC-G, HIPAC-B e HIPAC-S,
Phenomenex, Torrance, USA) para otimização da separação cromatográfica de oito padrões de
flavonóides: (3-O-[β-D-glicopiranosil-(1→6)-α-L-ramnopiranosil]-7-O-α-Lramnopiranosilkanferol;
hesperidina; kanferol; tilirosideo; quercetina; 3,4 ,7,8-tetra-O-metilgossipetina;
3,3 ,4 ,7,8-penta-O-metil-gossipetina; 3,3 ,4 ,7-tetra-O-metil-quercetina). O modelo
de retenção do HIPAC se baseia na conhecida relação linear entre o fator de retenção de um
analito e a porcentagem de solvente orgânico na fase móvel para simulação de dados de retenção.
Utilizando eluição em modo gradiente, três corridas preliminares foram realizadas (corridas
preliminares são usadas para inserir dados de retenção para o software). A primeira corrida
preliminar usou uma coluna C18 (250 x 4,6 mm, 5 m) e como fase móvel um gradiente de 5 a
95% de acetonitrila (solvente B) e acido fórmico a 0,1% (solvente A) a um fluxo de 1 mL/min
com detecção no ultravioleta a 264 nm. A primeira corrida preliminar foi composta de duas
corridas em modo gradiente usando as mesmas condições cromatográficas, mas com diferentes
durações de tempo de gradiente (30 e 60 minutos respectivamente). A segunda corrida preliminar
utilizou as mesmas condições cromatográficas da primeira, mas como modificador orgânico usou
metanol ao invés de acetonitrila e %B inicial e final de 10% e 100%, respectivamente. A terceira
corrida preliminar foi feita com as mesmas condições cromatográficas da segunda corrida, mas
utilizando uma coluna com fase estacionária e dimensões diferentes (C8, 150 x 4,6 mm, 5 m).
Os dados de retenção das três corridas preliminares foram usados para alimentar o software de
simulação, utilizando o módulo HIPAC-G. Para simulação em modo isocrático usou-se o módulo
HIPAC-B, tanto com uma coluna C8 (150 x 4,6 mm, 5 m) quanto C18 (250 x 4,6 mm 5 m) e
misturas binárias de MeOH (Solvente B) em 0,1% de ácido fórmico (Solvente A). Duas corridas
preliminares com 60% e 70%B foram realizadas para cada coluna e os dados de retenção
resultantes foram usados para alimentar a simulação. As condições otimizadas de separação
sugeridas pelo HIPAC-B foram usadas como dados para inserção no HIPAC-S para otimizar as
condições do sistema cromatográfico. O critério de otimização utilizado para todas as simulações
foi a resolução média global para todos os picos no cromatograma. No total, doze simulações em
modo gradiente e quatro simulações em modo isocrático foram realizadas. Os dados de retenção
simulados foram comparados com os dados experimentalmente obtidos para os oito flavonóides
padrões. O coeficiente de correlação (r2) entre os tempos simulados e observados para analitos
eluídos em modo gradiente variaram de 0,9416 a 0,9992 (n=12). O coeficiente de correlação em
modo isocrático variou de 0.9999 a 1 (n=4), indicando excelente eficiência em predizer dados de
retenção para a mistura testada. Tomados em conjunto, nossos resultados mostram que o uso de
softwares de simulação cromatográfica tal como HIPAC-G, HIPAC-B e HIPAC-S podem
constituir uma importante ferramenta na otimização das condições de separação de misturas
complexas, tais como as que são encontradas no campo de produtos naturais.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:tede.biblioteca.ufpb.br:tede/7253 |
| Date | 27 May 2008 |
| Creators | Figueiredo Junior, José Wilson |
| Contributors | Oliveira, Eduardo de Jesus |
| Publisher | Universidade Federal da Paraíba, Programa de Pós-Graduação em Serviço Social, UFPB, BR, Serviço Social |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFPB, instname:Universidade Federal da Paraíba, instacron:UFPB |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | -7419770476564296342, 600, 600, 600, 600, 1003270622026576471, -8796676102858938039, 3590462550136975366 |
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