La sénescence cellulaire est une barrière à la progression tumorale qui est contournée par les cellules
cancéreuses. Elle se met en place suivant différents événements tels que l’activation constante
d’oncogènes comme H-RAS et correspond à un arrêt stable du cycle cellulaire. Un autre aspect des
cellules sénescentes est la dégradation spécifique des protéines impliquées dans la régulation du
cycle cellulaire, la biogenèse des ribosomes, l’homéostasie mitochondriale et le métabolisme cellulaire.
Dans cette étude, nous voulions identifier quelles sont les contributions de la dégradation des
protéines spécifiques à l’homéostasie mitochondriale, au métabolisme cellulaire ainsi qu’à la biogenèse
des ribosomes. De plus, nous voulons voir comment la dégradation des protéines impliquées
dans ces voies affecte la sénescence cellulaire. Afin de répondre à ces questions, nous avons
divisé nos travaux en 2 parties. La première s’est concentrée sur les ribosomes et les altérations
de la biogenèse ribosomale dans la sénescence. La deuxième partie s’est focalisée sur la contribution
de la dégradation des protéines importantes pour le métabolisme cellulaire et l’homéostasie
mitochondriale.
Premièrement, nous avons identifié que la mise en place de la sénescence s’accompagne d’une
désynchronisation de la biogenèse des ribosomes. Plus précisément, certains ARNr sont moins
transcrits alors que la transcription de certaines protéiques ribosomiques n’est pas altérée. Ceci entraîne
un déséquilibre entre la quantité des protéines ribosomiques et celle des ARN ribosomiques.
Il provoque l’accumulation de ribo protéines en dehors des ribosomes. Ces protéines acquièrent en
conséquence de nouvelles fonctions. Nous avons identifié RPL29 comme une ribo protéine libre
du ribosome. Elle est accumulée dans les cellules sénescentes et peut être utilisée comme nouveau
biomarqueur afin d’identifier les cellules senescent in vitro et in vivo. L’identification d’un nouveau
biomarqueur de cellules sénescentes est cruciale car aucun marqueur spécifique de la sénescence
n’est encore disponible.
Par ailleurs, nous avons identifié RPS14 comme une protéine qui peut interagir avec le complexe
CDK4-cyclin D1 et ainsi, en inhibant son activité, elle limite la prolifération cellulaire. L’arrêt
du cycle cellulaire initié par cette protéine ribosomqiue hors du ribosome est indépendant de la
protéine suppressive p53. Ceci pourrait offrir une opportunité thérapeutqiue pour le traitement des
tumeurs déficientes pour l’expression de p53.
La deuxième partie de ce travail s’est concentrée sur les altérations du métabolisme cellulaire en
particulier le métabolisme du NAD et l’homéostasie mitochondriale. Dans un premier temps, nous
avons confirmé que la perte d’expression de protéines impliquées dans l’homéostasie mitochondriale
favorise la mise en place de la sénescence via l’accumulation de NADH et la stabilisation de
p53. De plus, nous avons observé que la diminution des régulateurs de l’homéostasie redox NAD+
et NADPH est suffisante pour induire l’entrée en sénescence. A l’inverse la normalisation de ce
paramètre est à l’origine d’un contournement de la sénescence.
Dans ce cadre, nous avons identifié un nouveau complexe protéique formé par l’enzyme malique,
la malate déshydrogénase et la pyruvate carboxylase dont les actions concertées transfèrent
l’ion hydrure du NADH vers le NADPH. Nous avons nommé ce complexe HTC pour complexe de
transfert d’hydrure. Les réactions métaboliques des protéines de l’HTC permettent la normalisation
des niveaux de NAD+ et de NADPH. L’augmentation des niveaux de NAD+ et de NADPH a
déjà été associé à la tumorigénèse. A travers ces travaux, nous avons constaté que la surexpression
des protéines qui forment le complexe HTC coopère avec l’oncogène Ras à la transformation de
cellules primaires. Par ailleurs, les enzymes du complexe HTC sont fortement exprimées in vivo au
niveau des cancers de la prostate d’origine murine ou humaine. De plus, inactivation d’une proteine
du complexe HTC déclenche l’entrée en sénescence des cellules tumorales y compris en l’absence
de p53.
Nous avons ainsi caractérisé un nouveau complexe multi-enzymatique qui peut reprogrammer
le métabolisme et empêcher la mise en place de la sénescence cellulaire. L’inhibition de la formation
du complexe HTC pourrait permettre de cibler spécifiquement sa fonction de novo tout en
limitant de bloquer l’activité physiologique normale des ces enzymes en dehors de ce complexe.
Par l’ensemble de ces travaux, nous avons mis en évidence l’importance des défauts de biogénèse
des ribosomes ainsi que des altérations métaboliques dans la mise en place et le maintien de la
sénescence. D’une part, l’accumulation de RPS14 en dehors des ribosomes constitue un nouveau
mécanisme de régulation du cycle cellulaire. De plus, l’accumulation de RPL29 dans le nucleole
constitue un nouveau biomarker de la senescence. D’autre part, l’identification du complexe HTC
a mise en évidence une nouvelle façon de contourner la sénescence et ainsi de contribuer à la
transformation de cellules primaires. Ces observations renforcent l’importance de la sénescence
cellulaire en tant que mécanisme de suppression tumorale. Ces découvertes créent de nouvelles
opportunités thérapeutiques afin de réactiver la sénescence dans les cellules cancéreuses. / Cellular senescence is a barrier to tumor progression that is circumvented in cancer cells. Senescence
is a stable cell cycle arrest and can be triggered by various oncogenic events, such as constant
activation of the oncogene H-RAS. Other critical aspects of senescent cells include a specific
degradation of proteins implicated in cell cycle regulation, ribosome biogenesis, mitochondrial
homeostasis, and cellular metabolism.
In this study, we wanted to identify the contributions of the specific protein degradation to
mitochondrial homeostasis, cellular metabolism, and ribosome biogenesis and how the degradation
of proteins implicated in those pathways affects the senescence response. In order to answer our
question, we divided our research into two aspects. The first aspect was focused on ribosomes and
the alterations in ribosome biogenesis in senescence. The second aspect was the contribution of
degradation of proteins implicated in cellular metabolism and mitochondrial homeostasis.
First, we identified that a desynchronization of ribosome biogenesis accompanies senescence,
meaning that certain rRNA are less transcribed, whereas specific ribosomal proteins do not decrease
their transcription leading to an imbalance in ribosomal protein and ribosomal RNA. This
imbalance causes an accumulation of ribosomal free riboproteins. Those accumulated riboproteins
acquire novel functions. We identified RPL29 as a ribosomal free riboprotein that accumulated in
senescent cells and can be used as a novel biomarker to identify senescent cells in vitro and in vivo.
Identification of novel senescent cell biomarkers is crucial as no specific marker of senescence is
available. Furthermore, we identified RPS14 as a protein that can interact with the CDK4-cyclinD1
complex and decrease cell cycle progression. Of utmost importance is that cell cycle repression
was even possible in cancer cells devoided of p53 highlighting novel strategies for p53 null cancer
treatments.
In the second part, we focused on alterations in cellular metabolism, particularly in light of
NAD metabolism and mitochondria homeostasis. We could confirm that the degradation of proteins
implicated in mitochondrial homeostasis can induce senescence via the accumulation of
NADH and p53 stabilization. Furthermore, we confirmed that the decrease in redox homeostasis
regulators, namely NAD+ and NADPH, can trigger senescence. In the same idea, we showed
that the normalization of those redox potentials could bypass the senescence response. Most importantly,
we identified a novel protein complex formed by malic enzyme, malate dehydrogenase,and pyruvate carboxylase. The concerted actions of those three metabolic enzymes can transfer
the hydride ion from NADH towards NADPH. Thus, we coined this complex HTC for hydride
transfer complex. These metabolic reactions in HTC allow for two things, the normalization of
NAD+ levels and the normalization of NADPH levels. Intruguenlty, both NAD+ and NADPH
level increase were previously linked to transformation, and indeed, we were able to show that
expression of HTC in combination with oncogenic Ras is sufficient to transform primary cells.
Moreover, HTC enzymes are highly expressed in vivo in mouse and human prostate cancer models,
and their inactivation triggers senescence even in the absence of p53. We provide evidence for
a new multi-enzymatic complex, with de novo functions that reprogram metabolism and prevent
cellular senescence. Inhibition of formation of the HTC complex might allow targeting specifically
the de novo function of this complex with fewer effects on normal enzyme function.
All in all, we highlighted the contributions of ribosome biogenesis and metabolic alterations
in inducing and maintaining the senescence response. Furthermore, RPS14 accumulation allows
for a novel cell cycle regulation mechanism, and the accumulation of RPL29 in the nucleolus
can be used as a novel biomarker for cellular senescence. Moreover, the expression of HTC
demonstrated a novel way of avoiding senescence, thus promoting cellular transformation. Both
pathways highlight the importance of cellular senescence as a tumor suppressors mechanism, and
these discoveries allow for novel strategies for cancer drug development. / Krebs ist eine der häufigsten Todesursachen in der westlichen Welt. Aus diesem Grund ist es von
hoher Bedeutung die molekularen Prozesse die eine Zelle entarten, also zum Krebs werden lassen
besonders genau zu untersuchen. Im Allgemeinen haben Zellen Mechanismen, die das Entarten
verhindern sollen, jedoch sind diese Mechanismen nicht immer fehlerfrei. Ein solcher Mechanismus
ist die Zellseneszenz. Dieser Schutzmechanismus kann auf verschiedene Weise, wie zum
Beispiel durch das Mutieren eines Onkogenes, aktiviert werden. Die Zellseneszenz ist dadurch
charakterisiert, dass sie potentielle Krebszellen an ihrer Zellteilung hindert und es deswegen zu
keiner Entstehung eines Karzinoms kommt. Wie bereits angedeutet sind die Mechanismen, welche
die Entartung von Zellen stoppen sollen nicht fehlerfrei und die Inaktivität dieser Schutzmechanismen
kann zur Entartung - auch maligne Transformation genannt - einer Zelle führen.
In dieser Doktorarbeit haben wir aufgezeigt, welche molekularen Prozesse in der Zelle aktiviert
bzw. verändert werden und dann dazu führen, dass der Schutzmechanismus der Zellseneszenz umgangen
wird. Im Allgemeinen haben wir zwei Prozesse, die während der malignen Transformation
verändert werden, untersucht. Dies ist auf der einen Seite die Veränderung von ribosomer Entwicklung
und auf der anderen Seite sind es die Veränderungsprozesse im Zellstoffwechsel. Ribosome
sind makromolekulare Komplexe in Zellen, die aus speziellen Proteinen und RNA aufgebaut sind
und besonders wichtig für die Zelle sind, da sie die Produktion von Proteinen ermöglichen.
Wir haben aufgezeigt, dass während der Aktivierung von Zellseneszenz die Produktion von
Ribosomen ungleichmäßig in der Zelle heruntergefahren wird. Dies führt dazu, dass bestimmte
Proteine, die wichtig für die Ribosomen sind sich im Zellkern bzw. im Kernkörperchen ansammeln.
Hier seien besonders zwei Protein zu nenen, RPS14 and RPL29. Wir haben festgestellt,
dass diese Ansammlung von RPL29 im Kernkörperchen als Biomarker für die Ermittlung von
Zellseneszenz in vivo dienen kann. Außerdem haben wir dargestellt, dass die Ansammlung von
dem Protein RPS14 dazu führt, dass der Zellzyklus gestoppt wird. Die Entdeckung von RPS14 als
Regulator für den Zellzyklus ist insofern wichtig, da dieser Prozess unabhängig von p53, einem
Protein welches in über 50 Prozent aller Krebsarten inaktiv ist, stattfinden kann.
Bisher waren zwei Mechanismen zur Zellzyklus Regulierung bekannt. Die Beschreibung von
RPS14 im Zellzyklus erlaubt uns einen weiteren Mechanismus hinzuzufügen. Die ist ein wichtiger
Schritt zur Erforschung von neuen Inhibitoren der Zellteilung.
Im zweiten Teil der Arbeit haben wir untersucht inwiefern der Zellstoffwechsel sich während
der Zellseneszenz verändert. Wir haben herausgefunden, dass sich das Niveau von wichtigen Co-
Faktoren, die den Redoxstatus der Zelle regulieren währender Zellseneszenz verändert. Insbesondere
das Molekül NAD+ zeigte eine starke Verringerung im Niveau. Weiterhin wussten wir, dass
das Niveau von NAD+ und auch das Niveau von NADPH, ein Molekül ähnlich dem NAD, in
Krebszellen besonders hoch ist.
Wir haben festgestellt, dass in der Zelle ein Proteinkomplex aus Stoffwechsel Proteinen entstehen
kann, welcher die Level von NAD+ und NADPH durch die Stoffwechselaktion dieser Proteine
wieder normalisiert. Dieser Komplex besteht aus drei Proteinen Malic Enzyme 1, Malate Dehydrogenase
1 und Pyruvate Carboxylase. Besonders hervorzuheben hierbei ist unsere Entdeckung, dass
Pyruvate Carboxylase in Krebszellen nicht nur in den Mitochondrien vorhanden ist, sondern auch
im Zellplasma. Die Aktivierung dieses Proteinkomplexes ermöglicht Zellen die normalerweise in
die Zellseneszenz gehen würden, diesen Schutzmechanismus zu umgehen und dabei bösartig zu
entarten. Diese Entdeckung ist besonders interessant, da der Zellstoffwechsel von Krebszellen seit
langem untersucht wird, es jedoch bisher noch nicht bekannt war das dieser Proteinkomplex in
der Lage ist die Zelle bösartig zu transformieren. Wir konnten nachweisen, dass die Proteinlevel
von unserem Komplex in Prostatakrebs im Vergleich zu normalem Prostatagewebe erhöht sind.
Darüber hinaus waren wir in der Lage zu zeigen, dass die Inaktivierung von einem der Proteine
aus dem Komplex dazu führt, dass die Zelle ihren Zellzyklus verlangsamt und weniger aggressiv in
einem Kanzerogenitätstest ist. Dies ist selbst dann möglich, wenn die Krebszelle über kein aktives
p53 Protein mehr verfügt. Besonders hervorzuheben diese Entdeckung, weil das p53 Protein eines
der wichtigsten Proteine ist, welches die Zelle vor einer bösartigen Transformation schützt.
Zusammenfassend ist zu sagen, dass wir zwei neue Mechanismen aufgezeigt haben die Veränderung
der Ribosomenproduktion und die Stoffwechselprozesse, die sich während der malignen
Transformation von Zellen verändern. In der Zukunft wird unsere Forschung versuchen zu verstehen
inwiefern diese neuen Erkenntnisse dazu genutzt werden können neue Moleküle zu entwickeln
die speziell die beschriebenen Prozesse nutzen, um den Zellzyklus von Krebszellen zu
verlangsamen.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:umontreal.ca/oai:papyrus.bib.umontreal.ca:1866/26873 |
| Date | 08 1900 |
| Creators | Igelmann, Sebastian |
| Contributors | Ferbeyre, Gerardo |
| Source Sets | Université de Montréal |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | thesis, thèse |
| Format | application/pdf |
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