O sistema circadiano das aves é composto pela retina, a região homóloga aos núcleos supraquiasmáticos de mamíferos (NSQ) e a glândula pineal. A retina apresenta muitos eventos fisiológicos rítmicos, como por exemplo os movimentos das células fotorreceptoras em vertebrados não mamíferos, a expressão de opsinas, regeneração do cromóforo visual e produção e liberação de melatonina e dopamina. Todos estes eventos rítmicos são coordenados para prever alterações nas condições luminosas que ocorrem durante o dia, otimizando a função retiniana. Neste trabalho foi investigada a expressão de componentes chave de um sistema circadiano, incluindo os dois genes de melanopsina, Opn4x e Opn4m, os genes de relógio Clock e Per2, e os genes das enzimas chave da síntese de melatonina, N-Acetiltransferase, e de dopamina, Tirosina Hidroxilase, em células da retina de embriões de galinha. Culturas primárias de retina de embriões de galinha com 8 dias foram preparadas no ZT0 (quando as luz é acesa) e semeadas na densidade de 107 células por frasco de 25 cm2 . As células foram mantidas em ambiente úmido, com 5% CO2, a 40o C, em escuro constante, fotoperíodo 12C:12E, fotoperíodo 12C:12E seguido de escuro constante, ou em escuro constante na presença e na ausência de glutamato 100 μM por 12 h. A extração de RNA total foi feita ao longo de 24 horas com intervalo de três horas tendo início no ZT0 do sexto dia. As amostras foram submetidas a RT-PCR seguido de PCR quantitativo para a quantificação de RNAm. Para confirmar a expressão da proteína OPN4x foi realizado ensaio imunohistoquímico com anticorpos anti-melanopsina de galinha desenvolvidos em coelho. Também foi feita a quantificação da concentração das proteínas OPN4x, CLOCK e TIROSINA HIDROXILASE através da técnica de Western Blot. A quantificação do RNAm em escuro constante não apresentou ritmos de transcrição para nenhum gene. Já as células mantidas em fotoperíodo 12C:12E apresentaram padrões rítmicos de transcrição para Clock, Per2, Opn4m, N-Acetiltransferase e Tirosina Hidroxilase. Glutamato 100 μM foi eficaz em induzir ritmo em Clock, e inibiu drasticamente a expressão de Tirosina Hidroxilase e, apenas mais pontualmente, de Opn4x e Opn4m. Ensaios de viabilidade celular e fragmentação de DNA por citometria de fluxo demonstraram que essa inibição não foi resultante de ação tóxica ou apoptótica do glutamato. O neurotransmissor não teve qualquer efeito sobre a transcrição de Per2 e de N-Acetiltransferase. A quantificação protéica não indicou a presença de ritmo para CLOCK, OPN4x ou TIROSINA HIDROXILASE. A grande variabilidade inter-ensaios nos resultados de quantificação protéica sugere uma menor sensibilidade e precisão para esse método, quando comparado a PCR quantitativo. Nossos resultados indicam que as células de retina de embrião de 8 dias de galinha em cultura já contêm um relógio funcional, porém, este necessita do ciclo claro-escuro ou glutamato para sua sincronização. / The avian circadian system is composed by the retina, the mammalian homolog region of the supra-chiasmatic nucleus (SNC) and the pineal gland. The retina itself shows many rhythmic physiological events, such as movements of photoreceptor cells, opsin expression, retinaldehyde re-isomerization, melatonin and dopamine production and release. Altogether these rhythmic events are coordinated to predict environmental changes in light conditions during the day, optimizing retina function. In this work we investigated the expression of key components of a circadian system, including the two melanopsin genes, Opn4x, Opn4m, as well as the Clock, Per2, N-Acetyltransferase and Tyrosine Hidroxylase genes in chick embryo retinal cells. Primary cultures of chicken retina from 8-day-old embryos were prepared at ZT0 (lights on) and seeded at the density of 107 cells per 25 cm2 culture flask. The cells were kept in a humidified incubator in a 5% CO2 atmosphere at 40o C in constant dark, in 12L:12D, in 12L:12D followed by constant dark, or in constant dark in the absence or presence of 100 μM glutamate for 12 h starting at ZT0 of the fifth day in vitro. Total RNA extraction was performed along 24 hours every three hours starting at ZT0 of the sixth day. The samples were submitted to RT-PCR followed by quantitative PCR for mRNA quantification. To analyze the Opn4x expression in these cells we performed an immunocytochemistry analysis with antibodies anti-chicken melanopsin developed in rabbit. We also quantified the protein levels of OPN4x, CLOCK AND TYROSINE HYDROXYLASE by Western Blot. The mRNA quantification showed no rhythm of transcription for any gene in cells kept in constant dark. However under a light-dark cycle, Clock, Per2, Opn4m, N-Acetyltransferase and Tyrosine Hydroxylase presented rhythm patterns of transcription. 100 μM glutamate was able to induce rhythmic expression of Clock, and strongly inhibited the expression of Tyrosine Hydroxylase and, just punctually, of Opn4x and Opn4m. Assays of cell viability and DNA fragmentation using flow cytometry demonstrated that the inhibition did not result of glutamate toxic or apoptotic actions. The neurotransmitter had no effect on Per2 and N-Acetyltransferase transcription. Protein quantification by Western Blot showed no rhythmic oscillation of CLOCK, OPN4x or TYROSINE HYDROXYLASE. The great variability inter-assays seen in the results of protein quantification suggests that this method is less precise and sensitive than quantitative PCR. The present data show evidences that chicken embryonic retinal cells contain a functional circadian Clock. However light-dark cycle or glutamate stimuli are needed to its synchronization.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-26112009-141152 |
| Date | 13 October 2009 |
| Creators | Leonardo Henrique Ribeiro Graciani de Lima |
| Contributors | Ana Maria de Lauro Castrucci, Debora Rejane Fior Chadi, Jose Cipolla Neto, Mauro César Isoldi, Regina Pekelmann Markus |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Fisiologia Geral, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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