Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-09-20T04:02:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2016 / A temperatura é considerada o fator que mais afeta a estabilidade viral no meio ambiente aquático, porém, outros fatores como a irradiação pela luz ultravioleta (U.V.), variações na salinidade e de pH e presença de outros micro-organismos podem também contribuir na diminuição da estabilidade viral. A presença e persistência viral no ambiente aquático deve ser monitorada para assegurar a qualidade da água, entretanto, em análises que envolvem uma grande quantidade de amostras, necessita-se a estocagem das amostras previamente às análises e muitas dúvidas existem em relação à estabilidade térmica dos patógenos virais em diferentes temperaturas de estocagem (22, 4, -20 e -80 °C). O objetivo da presente tese de doutoramento foi avaliar a estabilidade térmica de diferentes vírus entéricos: adenovírus humano tipo 2 (HAdV2), norovírus murino (MNV-1) e rotavírus humano (RV) cepa vacinal RotaTeq em amostras de água de superfície. Os resultados são aqui apresentados em quatro capítulos: Capítulo I: Otimização das técnicas baseadas em cultura celular: ensaio de placa de lise (PL), citometria de fluxo (CF) e ICC-et-RT-qPCR (qPCR precedido por cultura celular, tratamento enzimático e transcrição reversa) para determinar o limite de detecção de HAdV2 em amostras de água da Lagoa do Peri. Foi possível verificar que a composição da água não interferiu na detecção HAdV2 infecciosos e que o método de PL apresentou maior limite de detecção em relação à CF e ao ICC-et-RT-qPCR. As diferenças nos limites de detecção obtidos deveram-se à diferenças inerentes a cada metodologia sendo as três adotadas para avaliar a estabilidade térmica do HAdV2 realizada no Capítulo II. Capítulo II: Avaliação da estabilidade térmica do HAdV2 e MNV-1 semeados em amostras de água de superfície provenientes da Lagoa do Peri e estocadas a temperaturas de 22, 4, -20 e -80 °C. A infecciosidade do HAdV2 foi avaliada pelo período de 230 dias utilizando as técnicas citadas acima e para o MNV-1 pelo período de 180 dias utilizando PL e RT-qPCR. O HAdV2 independentemente da técnica utilizada demonstrou um perfil de decaimento em relação às temperaturas de: -80<-20<4<22 °C, sendo que, com exceção das amostras estocadas a 22 °C, o HAdV2 presente nas amostras permaneceu potencialmente infeccioso por um período acima de 230 dias de análise. O MNV-1 mostrou um perfil de decaimento diferente, em relação à técnica de PL: -80<4<-20<22 °C e o mesmo perfil apresentado pelo HAdV2 quando as amostras foram analisadas por RT-qPCR. O modelo de regressão linear estimou o tempo de inativação necessário para o decaimento de 1log10 (T90), de 50 e 33 dias respectivamente para o HAdV2 e MNV-1 quando estocados a 22 °C e avaliado por PL. Sugere-se a estocagem de amostras ambientais a 4 °C pelo período de 48 h e a -80 °C para longos períodos de estocagem. Capítulo III: Avaliação da estabilidade térmica do RV cepa vacinal nas temperaturas de 22 e 4 °C em amostras de água de manancial (Lagoa do Peri), água salobra (Lagoa da Conceição) e água de consumo não clorada durante 180 dias por PL e RT-qPCR. A estabilidade da partícula viral e do genoma foi maior quando as amostras foram estocadas a 4 °C do que a 22 °C, sendo que as amostras de água salobra apresentaram os maiores valores de decaimento em ambas as temperaturas e técnicas utilizadas, seguidas pela água da Lagoa do Peri e água de consumo. Além da ação da temperatura na inativação viral, as características físico-químicas, como a salinidade e a presença de outros micro-organismos nas amostras da Lagoa da Conceição podem ter influenciado no maior decaimento viral observado. Os valores de T90 foram de 18, 55 e 58 dias a 22 °C e 68, 155 e 240 dias a 4 °C respectivamente para as amostras da Lagoa da Conceição, Lagoa do Peri e água de consumo. A estabilidade das partículas infecciosas do RV indica a potencial transmissão horizontal da cepa vacinal. Entretanto, devido ao caráter atenuado da vacina, o monitoramento da presença de cepas vacinais e de possíveis rearranjos gênicos entre as cepas selvagens e vacinais deve ser avaliado para garantir a segurança das vacinas disponíveis, a verificação da presença de novos genótipos, auxiliando futuros estudos epidemiológicos. Capítulo IV: A padronização da metodologia de hibridização por sonda Molecular Beacon (MB) para monitorar a estabilidade do HAdV2 em águas fez parte do projeto de doutorado sanduíche realizado na Universidade da Califórnia, Riverside, EUA. O uso da sonda MB na detecção de HAdV2 foi padronizado utilizando a metodologia de conjugação ao peptídeo TAT (MB/TAT) e método de fixação e permeabilização celular comparando os resultados com a metodologia de imunofluorescência indireta (IFI). Pelo método MB/TAT foi possível visualizar o aparecimento de células fluorescentes após 6 h de infecção, com incremento da fluorescência após 8 h e, ao final de 24 h, a observação de células fluorescentes nas diferentes concentrações virais testadas. A metodologia de IFI permitiu, assim como na MB/TAT, o acompanhamento da infecção viral iniciando-se após 6 h de infecção, culminando no tempo de 24 h com um grande número de células infectadas e efeito citopático aparente. O uso da metodologia MB/TAT padronizada eliminou inúmeros passos de incubação e lavagens necessários para a IFI, entretanto precisará ser ajustada em relação à quantificação de células fluorescentes e tempos de incubação para sua posterior aplicação em amostras de águas.<br> / Abstract : The temperature is considered the main factor affecting viral stability in the aquatic environment, however, other factors such as ultra violet light irradiation (U.V.), salt concentration, pH variations and the presence of other microorganisms can also contribute to the loss of viral infectivity. Viruses presence and persistence should be monitored in the aquatic environment regarding water quality; however, extensive sampling schedules may require sample storage prior analyses. Currently, there is a lack of studies evaluating the thermal stability of viral pathogens when subjected to different storage temperatures (22, 4, -20 e -80 °C). The aim of this PhD thesis was to evaluate the thermal stability of different enteric viruses: human adenovirus type 2 (HAdV2), murine norovirus (MNV-1) and human rotavirus (RV) RotaTeq vaccine strain in surface water samples. The results are presented in four chapters: Chapter I: Optimization of the cell culture based-methods: plaque assay (PA), flow cytometry (FC) and ICC-et-RT-qPCR (qPCR preceded by cell culture, enzymatic treatment, and reverse transcription) to determine the detection limit of HAdV2 in water samples from Lagoa do Peri. The results showed that the water composition did not affect the detection of infectious HAdV2, being the detection limit higher by PA in comparison to FC and ICC-et-RT-qPCR methods. These differences are inherent according each methodology, and thus, the three methods were employed to evaluate the thermal stability of HAdV2 performed in Chapter II. Chapter II: The thermal stability of HAdV2 and MNV-1 seeded in surface freshwater from Lagoa do Peri and stored at temperatures of 22, 4, -20 and -80 °C was evaluated up to 230 days for the HAdV2 by the three methods mentioned above and over 180 days period for the MNV-1 using PA and RT-qPCR. Regardless the methodology employed, the HAdV2 demonstrated a viral decay profile according the temperatures as follows: -80<-20<4<22 °C, and, except for samples stored at 22 °C, HAdV2 present in the samples remained potentially viable for a period up to 230 days of analysis. The MNV-1 showed a different decay profile in relation to the PA technique, as follows: -80<4<-20<22 °C and the same profile presented by HAdV2 when the samples were analyzed by RT-qPCR. The T90 values (time required to 1log10 inactivation) estimated by linear regression model, were 50 and 33 days respectively for HAdV2 and MNV-1 when stored at 22 °C and evaluated by PA. These findings suggest the sample storage prior analyses at 4 °C for a short period (48 h) and -80 °C for long term storage periods. Chapter III: Evaluation of the thermal stability of RV vaccine strain stored at the temperatures of 22 and 4 °C in different water matrices: surface freshwater (Lagoa do Peri), brackish water (Lagoa da Conceição) and non-chlorinated drinking water over a 180 days period by PA and RT-qPCR. Regardless the storage temperature the viral particle stability was more affected than the genomic stability, highlighting the highest decay obtained for the brackish water samples in both temperatures, followed by Lagoa do Peri and drinking water samples. The highest reduction on the virus titer obtained in this water sample is probably due to the action of the temperature and physicochemical characteristics, such as salinity concentration and also, the presence of other microorganisms in this environment, that may contribute on the virus loss due to predation. The samples stored at 22 °C showed the lowest T90 values 18, 55 and 58 days and at 4 °C the T90 values were 68, 155 and 240 days respectively for samples from Lagoa da Conceição, Lagoa do Peri and drinking water. The stability of infectious RV vaccine strain particles shows the potential horizontal transmission of the vaccine. Due to its attenuated nature, the presence of vaccine strains and the possible occurrence of gene reassortments between wild and vaccine strains should be monitorated regarding vaccine safety, circulation of new genotypes, as well, further epidemiological studies. Chapter IV: The validation of the HAdV2 detection by using a Molecular Beacon (MB) hybridization methodology to evaluate HAdV2 stability in water samples was part of the sandwich PhD project performed at the University of California, Riverside, USA. Two different approaches were employed in order to HAdV2 detection using MB probe: MB conjugated with TAT peptide (MB/TAT) and a cell fixation and permeabilization method. Both methodologies were compared with the Indirect Immunofluorescence (IFA). By applying the MB/TAT method it was possible to observe fluorescent cells, indicating the beginning of viral replication within 6 h post infection. The fluorescence signals increased after 8 and 24 h post infection showing differences between the virus concentrations over time. The IFA methodology, as observed in MB/TAT, allowed monitoring the virus infection over the period analyzed, which the first fluorescence signals starting at 6 h post infection, ending the period of 24 h with a large number of infected cells and apparent cytopathic effect. The MB/TAT methodology standardized is more rapid and effective than IFA because avoid several steps of incubation and washes, however, it must be adjusted in relation to the quantification of fluorescent cells and incubation times for further application in water samples .
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufsc.br:123456789/167603 |
| Date | January 2016 |
| Creators | Moresco, Vanessa |
| Contributors | Universidade Federal de Santa Catarina, Barardi, Celia Regina Monte |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | 156 p.| il., grafs., tabs. |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSC, instname:Universidade Federal de Santa Catarina, instacron:UFSC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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