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Previous issue date: 2007-04-20 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The arboviruses represent serious problems of public health in Brazil, in particular in the Amazon area. Four arboviruses have shown to be particularly important, namely dengue, yellow, Oropouche and Mayaro, since they cause severe human disease with high mortalities and are involved in periodic outbreaks. The mapping of the main arboviruses in the Rondonia State is necessary, as well as the knowledge of their biological cycles, in order to define control measures with the understanding of their period and mechanisms of transmission. It is also necessary to improve diagnostic procedures by viral isolation and molecular characterization by RT-PCR, with the primers selected for identification of these viruses, directly from the serum or tissue fluids of patients, or indirectly from cell cultures inoculated with patient s materials.
In the present manuscript are presented results of arbovirus isolation and characterization procedures from two hundred and sixty six samples of blood colleted from patients with suspected of arboviruses infections in the following Rondonia State s cities: Ariquemes, Cacoal, Colorado D´Oeste, Jarú, Ouro Preto D´Oeste, Porto Velho, Theobroma and Vilhena. The samples were inoculated in C6/36 monolayers and after seven days the cellular supernatants were collected for RNA extraction by Trizol® method. The RNA extracted was used for RT-PCR with primers selected from the specialized literature s data. The universal primer was selected for identify Flavivirus, Alphavirus genera and Simbu serogroup. Specific primers were also used to identify the four serotypes of dengue virus and yellow fever virus. The amplicons were submitted to electrophoresis in agarose gel 1,7% and visualized in ultra violet light. For genetic sequencing was used the interruption of extention of chain of nucleotide by dideoxynucleotide technique. The ABI PRISM 310 Genetic Analyser (PE Biosyntesis) was used for sequencing the dengue virus serotype 1, the Personal Seq 4X4 (Amersham Pharmacia Biotech, USA), for sequencing the dengue virus serotype 3 and the Mega BACE1000 (Amersham Pharmacia Biotech, USA) for sequencing the Cacipacore virus. One hundred fourteen samples were indentifyed by RT-PCR. The results of identification of positive collected samples from different periods of 2003 to 2005 was the following: 70 patients with dengue serotype 1, one patient with dengue serotype 2, 42 patients with dengue serotype 3 and one patient com Cacipacore virus. The genetic sequencing performed of dengue virus serotypes 1 and 3 samples analyzed by software Clustal W showed 98% of similarity with others dengue virus isolated and sequenced in southeastern areas of Brazil. The Cacipacore virus sample isolated fom the Theobroma patient was the first sample isolated from human infections and presented 91% of similarity with others virus samples isolated in Brazil from migratory birds.
We concluded from, our studies, that the epidemiologic surveillance, using molecular methods associated to serological ones is more accurate and precise than serological methods alone. It must be added the easiness of the procedure and the speed for getting the result in contrast with complicated methodologies like hemaglutination inhibition or complement fixation methodologies that need double samples and eventually give cross-reacting results with others arboviruses. The selected primers, for Multiplex-RT-PCR and for nested-RT-PCR used in this work, identify the main arboviruses circulating not only in the Rondonia State that can be used in other centers of research in the region north region of Brazil. Our results also emphasize the agility of the method consisting in the direct use of patient s serum for the RT-PCR procedure which reduces the time for getting a diagnosis. / As arboviroses representam graves problemas de saúde pública no Brasil, particularmente na Região Amazônica. Quatro arboviroses têm-se mostrado especialmente relevantes, a saber: dengue, febre amarela, Oropouche e Mayaro, pois causam doenças humanas graves, com mortalidade relativamente elevada e são responsáveis por surtos epidêmicos. O mapeamento e caracterização dos principais arbovírus registrados no Estado de Rondônia são necessários para identificar quais estão circulando, definir o período de transmissão e seu diagnóstico através de isolamento viral e caracterização molecular pela técnica de RT-PCR,
Isso foi realizado neste estudo com a seleção de primers para a identificação desses vírus tanto isolados a partir do soro do paciente quanto a partir de culturas celulares semeadas com soro dos pacientes.
No presente trabalho, é apresentado resultado de isolamento e caracterização de arbovírus a partir de duzentas e sessenta e seis amostras de sangue coletadas de pacientes com suspeitas de arbovirose nas cidades de Ariquemes, Cacoal, Colorado D Oeste, Jarú, Ouro Preto D Oeste, Porto Velho, Theobroma e Vilhena. As amostras foram inoculadas em culturas de células C6/36 e após sete dias os fluídos celulares foram recolhidos e submetidos à extração de RNA pelo método do TRIzol®. O RNA extraído foi utilizado para RT-PCR com os primers selecionados na literatura especializada. Os primers universais para Flavivirus, Alphavirus, para os quatro sorotipos de dengue, para o sorogrupo Simbu e especifico para febre amarela foram testados nessas amostras. Os amplicons foram submetidos à corrida eletroforética em géis de agarose 1,7% e visualizados em transiluminador ultravioleta. Para o seqüencimento gênico utilizou-se a técnica de interrupção da cadeia por dideoxinucleotídios. Foram utilizados os seqüenciadores ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (PE Biosynthesis, USA), para seqüenciar o vírus dengue sorotipo 1, o Personal Seq 4X4 (Amersham Pharmacia Biotech, USA), para seqüenciar o genoma do vírus da dengue sorotipo 3 e o Mega BACE 1000 (Amersham Pharmacia Biotech, USA), para seqüenciar o vírus Cacipacoré. Cento e quatorze amostras foram identificadas após a realização da RT-PCR.
Os resultados de isolamento e caracterização das amostras virais foi o seguinte: 70 pacientes com dengue sorotipo 1, um paciente com dengue sorotipo 2; 42 pacientes com dengue sorotipo 3 e um paciente com o vírus Cacipacoré. A seqüência gênica dos vírus da dengue sorotipos 1 e 3 foram analisadas pelo programa Clustal W e apresentaram 98% de semelhança com aqueles isolados em regiões do sudeste do Brasil. Note-se que a amostra isolada de vírus Cacipacoré representa o primeiro isolamento do vírus de seres humanos e seu seqüenciamento apresentou 91% de similaridade com o de amostras isoladas precedentemente de aves migratórias selvagens.
Concluiu-se nestes estudos que a vigilância epidemiológica, associando métodos moleculares e sorológicos de caracterização viral são mais precisos do que aquela feita apenas por técnicas sorológicas. Soma-se a isso o grau de relativa facilidade para se obter o resultado, não sendo uma metodologia que implica em interpretação complexa como a Inibição da Hemaglutinação ou Fixação do Complemento, técnicas que necessitam de amostras pareadas e eventualmente podem fornecer reações cruzadas entre diferentes viroses. Os primers escolhidos tanto para Multiplex-RT-PCR, quanto para Nested-RT-PCR usados neste trabalho, identificam as principais arboviroses circulantes no Estado de Rondônia, e podem ser usados em outros centros de pesquisas na região norte.
Os resultados destes estudos mostram que a agilidade do uso direto do soro de pacientes com suspeitas de arboviroses como fonte de material para a RT-PCR recomendam o uso dessa técnica, pois diminui o tempo na obtenção do resultado.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:http://localhost:tede/3106 |
| Date | 20 April 2007 |
| Creators | Batista, Weber Cheli |
| Contributors | Silva, Luiz Hildebrando Pereira da |
| Publisher | Universidade Federal do Amazonas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, UFAM, BR, Instituto de Ciências Biológicas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFAM, instname:Universidade Federal do Amazonas, instacron:UFAM |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 32215883775770440, 600 |
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