O presente projeto analisou a expressão gênica de Amblyomin -X, uma proteína com potencial terapêutico expressa em Escherichia coli BL21(DE3), por intermédio de um vetor de expressão plasmideal induzido por IPTG ( Isopropyl α-D-1-thiogalactopyranoside). A quantificação da expressão gênica foi realizada utilizando a técnica de RT-qPCR absoluta. A molécula Amblyomin-X corresponde a um inibidor de serino protease do tipo Kunitz, que apresenta atividade antitumoral e anticoagulante. Devido a sua importância terapêutica, fez-se necessário implementar um protocolo de escalonamento de produção, utilizando biorreatores. A informação sobre expressão gênica pode ajudar a interpretar o funcionamento do microrganismo durante os cultivos em frascos agitados e biorreatores, auxiliando na obtenção de protocolos de cultivo. A partir do momento da indução do gene Amblyomin-X, a bactéria Escherichia coli recombinante direciona grande parte de seu metabolismo para a expressão e produção dessa proteína, que é expressa em forma de corpos de inclusão insolúveis. As proteínas em forma de corpos de inclusão insolúveis permitem uma fácil extração do produto, porém, dificulta na quantificação por técnicas cromatográficas, por esse motivo, buscou-se também uma correlação entre a expressão gênica e a síntese protéica de Amblyomin-X, com o objetivo de validar a quantificação por RT-qPCR como uma forma indireta de quantificação desse tipo de produto protéico. Poucos estudos abordam a correlação existente entre a expressão gênica e a síntese protéica de um gene e sua proteína, e essa comparação poderia, também, revelar aspectos importantes entre a transcrição e a tradução de proteínas heterólogas em microrganismo. Foram realizados experimentos em frascos agitados em duas diferentes temperaturas indução (37°C e 30°C), com a concentração do indutor IPTG de 1 mM e concentração da biomassa (X) de 0,2 g/L. Para os experimentos em biorreatores utilizou-se o ponto central do planejamento experimental com concentração de IPTG 1mM e mais duas condições com concentração de IPTG 0,1 mM e 2mM. Foi encontrada uma grande similaridade entre os gráficos das análises cinéticas referentes a expressão gênica e a velocidade específica de formação do produto (qP). Não foi possível Identificar uma semelhança entre o perfil referente a análise cinética da expressão gênica comparada com a síntese protéica. Esses resultados sugerem que a expressão gênica apresenta uma cinética semelhante a velocidade específica de formação do produto e não necessariamente a concentração de proteína. Não foram encontradas correlações significativas nas análises de cada momento após a indução, exceto pelo ponto t4 do biorreator 14, quando foram correlacionadas a expressão gênica e a velocidade de formação do produto (r=0,998 e valor P=0,03). / The present work analysed the gene expression of Amblyomin-X, a potential therapeutic protein expressed in a recombinant Escherichia coli with a plasmid vector inducible by IPTG ( Isopropyl β-D-1- thiogalactopyranoside). The gene expression was quantified by absolute RT-qPCR method. Amblyomin-X is a Kunitz-type serine protease inhibitor which demonstrates antitumor and anticoagulant activity. Due to Amblyomin therapeutic importance, it was necessary to implement a production protocol using bioreactors. The information on gene expression can helps to understand the microorganism behavior during the cultures in shaken flasks and bioreactors. From the moment of the induction of the gene Amblyomin-X, the recombinant Escherichia coli directs its metabolism for expression and production of this protein. The Amblyomin-X protein is expressed as insoluble inclusion bodies. Insoluble inclusion bodies proteins can be easyly extracted from the cell, however it difficults its quantification by chromatographic techniques. Because of that, besides analysis of the gene expression, by RT-qPCR method, we tried to correlate the gene expression with their protein levels concentration, whose objective was implement the RT-qPCR as an indirect method to quantify these type of protein product. Few studies correlate the gene expression in their protein, and this comparison can contribute to reveal important aspects between transcription and translation of heterologous proteins in Escherichia coli, for the achievement of scale up process in biorreactors. Therefore, the quantification by RT-qPCR, represents a most secure way to understand the expression of heterologous proteins in recombinant systems. Experiments were performed in shaken flasks at two different induction temperatures (37 °C and 30 °C), 0,2 g/L of biomass (X) at the induction moment with IPTG 1mM. Biorreactors are performed with three different IPTG concentrations (0,1 mM, 1 mM and 2 mM). A great similarity was found between the graphs of the kinetic analyzes concerning gene expression and the specific rate of product formation (qP). It was not possible to identify a similarity between the profile concerning kinetic analysis of gene expression compared to protein synthesis. These results suggest that gene expression exhibits similar kinetics to the specific rate of product formation and not necessarily to the protein concentration. were found no significant correlations in the analyzes of each moment after induction, except for point t4 of the bioreactor 14, when the gene expression and the rate of the product formation were positively correlated (r = 0.998 and P value = 0.03).
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-04122018-100546 |
| Date | 08 June 2018 |
| Creators | Santos, Murilo Marconi dos |
| Contributors | Tavassi, Ana Marisa Chudzinski |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Reter o conteúdo por motivos de patente, publicação e/ou direitos autoriais. |
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