O presente projeto analisou a expressão gênica de Amblyomin -X, uma proteína com potencial terapêutico expressa em Escherichia coli BL21(DE3), por intermédio de um vetor de expressão plasmideal induzido por IPTG ( Isopropyl α-D-1-thiogalactopyranoside). A quantificação da expressão gênica foi realizada utilizando a técnica de RT-qPCR absoluta. A molécula Amblyomin-X corresponde a um inibidor de serino protease do tipo Kunitz, que apresenta atividade antitumoral e anticoagulante. Devido a sua importância terapêutica, fez-se necessário implementar um protocolo de escalonamento de produção, utilizando biorreatores. A informação sobre expressão gênica pode ajudar a interpretar o funcionamento do microrganismo durante os cultivos em frascos agitados e biorreatores, auxiliando na obtenção de protocolos de cultivo. A partir do momento da indução do gene Amblyomin-X, a bactéria Escherichia coli recombinante direciona grande parte de seu metabolismo para a expressão e produção dessa proteína, que é expressa em forma de corpos de inclusão insolúveis. As proteínas em forma de corpos de inclusão insolúveis permitem uma fácil extração do produto, porém, dificulta na quantificação por técnicas cromatográficas, por esse motivo, buscou-se também uma correlação entre a expressão gênica e a síntese protéica de Amblyomin-X, com o objetivo de validar a quantificação por RT-qPCR como uma forma indireta de quantificação desse tipo de produto protéico. Poucos estudos abordam a correlação existente entre a expressão gênica e a síntese protéica de um gene e sua proteína, e essa comparação poderia, também, revelar aspectos importantes entre a transcrição e a tradução de proteínas heterólogas em microrganismo. Foram realizados experimentos em frascos agitados em duas diferentes temperaturas indução (37°C e 30°C), com a concentração do indutor IPTG de 1 mM e concentração da biomassa (X) de 0,2 g/L. Para os experimentos em biorreatores utilizou-se o ponto central do planejamento experimental com concentração de IPTG 1mM e mais duas condições com concentração de IPTG 0,1 mM e 2mM. Foi encontrada uma grande similaridade entre os gráficos das análises cinéticas referentes a expressão gênica e a velocidade específica de formação do produto (qP). Não foi possível Identificar uma semelhança entre o perfil referente a análise cinética da expressão gênica comparada com a síntese protéica. Esses resultados sugerem que a expressão gênica apresenta uma cinética semelhante a velocidade específica de formação do produto e não necessariamente a concentração de proteína. Não foram encontradas correlações significativas nas análises de cada momento após a indução, exceto pelo ponto t4 do biorreator 14, quando foram correlacionadas a expressão gênica e a velocidade de formação do produto (r=0,998 e valor P=0,03). / The present work analysed the gene expression of Amblyomin-X, a potential therapeutic protein expressed in a recombinant Escherichia coli with a plasmid vector inducible by IPTG ( Isopropyl β-D-1- thiogalactopyranoside). The gene expression was quantified by absolute RT-qPCR method. Amblyomin-X is a Kunitz-type serine protease inhibitor which demonstrates antitumor and anticoagulant activity. Due to Amblyomin therapeutic importance, it was necessary to implement a production protocol using bioreactors. The information on gene expression can helps to understand the microorganism behavior during the cultures in shaken flasks and bioreactors. From the moment of the induction of the gene Amblyomin-X, the recombinant Escherichia coli directs its metabolism for expression and production of this protein. The Amblyomin-X protein is expressed as insoluble inclusion bodies. Insoluble inclusion bodies proteins can be easyly extracted from the cell, however it difficults its quantification by chromatographic techniques. Because of that, besides analysis of the gene expression, by RT-qPCR method, we tried to correlate the gene expression with their protein levels concentration, whose objective was implement the RT-qPCR as an indirect method to quantify these type of protein product. Few studies correlate the gene expression in their protein, and this comparison can contribute to reveal important aspects between transcription and translation of heterologous proteins in Escherichia coli, for the achievement of scale up process in biorreactors. Therefore, the quantification by RT-qPCR, represents a most secure way to understand the expression of heterologous proteins in recombinant systems. Experiments were performed in shaken flasks at two different induction temperatures (37 °C and 30 °C), 0,2 g/L of biomass (X) at the induction moment with IPTG 1mM. Biorreactors are performed with three different IPTG concentrations (0,1 mM, 1 mM and 2 mM). A great similarity was found between the graphs of the kinetic analyzes concerning gene expression and the specific rate of product formation (qP). It was not possible to identify a similarity between the profile concerning kinetic analysis of gene expression compared to protein synthesis. These results suggest that gene expression exhibits similar kinetics to the specific rate of product formation and not necessarily to the protein concentration. were found no significant correlations in the analyzes of each moment after induction, except for point t4 of the bioreactor 14, when the gene expression and the rate of the product formation were positively correlated (r = 0.998 and P value = 0.03).

O câncer é um problema de saúde pública, especialmente entre os países em desenvolvimento. Está entre as doenças de maior taxa de mortalidade e é responsável por mais de 12% de todas as causas de óbito no mundo. Uma proteína denominda Amblyomin-X foi obtida a partir de uma biblioteca de cDNA das glândulas salivares do carrapato Amblyomma Cajennense e expressa na bactéria Escherichia coli BL21DE3. Essa proteína é capaz de induzir a morte de células tumorais, além de ter pouca ou nenhuma atividade contra células normais, diminuindo assim os efeitos colaterais nos pacientes em tratamentos contra o câncer. Através deste trabalho foi possível elaborar um protocolo para obtenção de elevadas concentrações celulares e produção da proteína recombinante AmblyominX em biorreatores com capacidade total de 15 L. Uma vez que a proteína é intracelular, foram estudados alguns parâmetros e estratégias de cultivo do microrganismo para obtenção de alta concentração celular, tais como: composição do meio de cultura, identificação dos substratos limitantes e inibitórios e vazão de alimentação da fonte de carbono. Foi definido um meio de cultura adequado para atingir elevadas concentrações celulares na etapa de crescimento da E. coli, visando garantir elevadas concentrações de produto recombinante. Ensaios conduzidos em biorreatores com esse meio resultaram em concentrações celulares e densidade ótica (DO600nm) iguais a 40,0 g/L e 76,6, respectivamente, para a etapa de crescimento celular e 59,8 g/L e 161, respectivamente, no final da etapa de produção da proteína de interesse. Os ensaios conduzidos em reatores mostraram que concentrações de ácido acético acima de 0,4 g/L causam inibição do crescimento celular, portanto, foi elaborada uma estratégia eficaz de alimentação exponencial dos substratos limitantes (fontes de carbono e magnésio) na etapa de crescimento dessa bactéria para atingir elevadas concentrações celulares, mantendo-se a velocidade específica de crescimento (µx) menor que 0,2 h-1, abaixo do valor máximo, com a finalidade de evitar a formação de ácido acético. Este trabalho permitiu também conhecer os parâmetros cinéticos para a produção da proteína Amblyomin-X, tais como, a velocidade específica máxima de crescimento (max), a produtividade celular global (Pxglobal), a produtividade celular máxima (Pxmáx) e o fator de conversão de substrato em célula (Yx/s) na etapa de batelada alimentada, cujos valores foram, respectivamente, de 0,30 h-1, 13,8 g de célula/h, 14,1 g de célula/h e 0,37 g de célula/g de substrato. Para a avaliação da biossíntese da proteína recombinante foram realizadas análises de gel de poliacrilamida por eletroforese e a quantificação foi feita pela análise de Bradford. A concentração de proteína Amblyomin-X no final da etapa de síntese alcançou 8,57 g/L. / Cancer is a public health problem, especially among developing countries. It is among the diseases with the highest mortality rate and accounts for more than 12% of all causes of death in the world. A protein called Amblyomin-X was obtained from a cDNA library of Amblyomma Cajennense tick salivary glands and it was expressed in the bacterium Escherichia coli BL21DE3. This protein is able to induce death of tumor cells, as well as having little or no activity against normal cells, thus reducing the side effects in patients on cancer treatments. In this work it was possible to elaborate a protocol for obtaining high cellular concentrations and production of the recombinant Amblyomin-X protein in bioreactors with a total capacity of 15 L. Since the protein is intracellular, some parameters and strategies of culture of the microorganism for obtaining a high cell concentration, were: composition of the culture medium, identification of limiting and inhibitory substrates and feed rate of the carbon source. A culture medium suitable for achieving high cell concentrations in the growth stage of E. coli was defined in order to guarantee high concentrations of recombinant product. Experiments conducted in bioreactors with this medium resulted in cellular concentrations and optical density (DO600nm) of 40.0 g / L and 76.6, respectively, for the cell growth step and 59.8 g / L and 161, respectively, at the end of the production stage of the protein of interest. Experiments conducted in reactors showed that acetic acid concentrations higher than 0.4 g/L cause inhibition of cell growth, therefore, an effective strategy of exponential feeding of the limiting substrates (carbon and magnesium sources) was elaborated in the growth stage of this bacteria to reach high cellular concentrations, maintaining the specific growth rate (µx) less than 0.2 h-1, below the maximum value, in order to avoid the formation of acetic acid. This work also allowed to know the kinetic parameters for Amblyomin-X protein production, such as the maximum specific growth rate (max), the overall cellular productivity (Pxglobal), the maximum cellular productivity (Pxmax) and the conversion factor of substrate in cell (Yx/s) in the fed batch stage, whose values were respectively 0.30 h-1, 13.8 g cell/h, 14.1 g cell/h and 0.37 g of cell/g of substrate. For the evaluation of recombinant protein biosynthesis, polyacrylamide gel analyzes were performed by electrophoresis and quantification was done by the Bradford analysis. The Amblyomin-X protein concentration at the end of the synthesis step reached 8.57 g/L.

A produção de biofármacos segue um crescente interesse industrial e social. Atualmente existem vários tipos de tratamento contra o câncer, porém, a maioria desses tratamentos não atua unicamente no alvo terapêutico. Um estudo realizado por pesquisadores do Instituto Butantan identificou uma proteína com ação anticoagulante e antitumoral, codificada por um gene proveniente das glândulas salivares do carrapato Amblyoma cajennense . Esse gene foi inserido em um plasmídeo e expresso com sucesso na bactéria Escherichia coli BL21DE3. Estudos pré-clínicos mostraram que a injeção in vivo de Amblyomin-X reduziu a formação de massa tumoral induzida por células de melanoma B16F10 em camundongos. Este trabalho contempla o estudo das condições de cultivo para obtenção da proteína Amblyomin-X com a linhagem Escherichia coli BL21DE3 recombinante em biorreatores. Para se determinar a melhor condição de biossíntese da proteína recombinante Amblyomin-X estabeleceu-se uma estratégia de cultivo para a etapa de crescimento do microrganismo e estudaram-se três diferentes fatores na etapa posterior à do crescimento microbiano, ou seja, na etapa de biossíntese da proteína: i) a concentração do indutor IPTG (Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo) no momento de indução da proteína; ii) a temperatura de cultivo durante a etapa de biossíntese da proteína; e iii) a concentração celular no início da etapa de biossíntese da proteína. Para a realização dos ensaios foi proposto um planejamento experimental delineamento composto central rotacional (DCCR) escolhido para os três fatores em estudo e resultou na condução de 17 ensaios. Os ensaios foram realizados com a estratégia de condução proposta, mantendo o valor de &#956x entre 0,20 e 0,23 h-1 na etapa de batelada alimentada, o que possibilitou atingir a concentração celular desejada com a formação de ácido acético em concentrações não inibitórias. Como resultado do planejamento experimental, a obtenção dos valores ótimos dos fatores para a etapa de produção da proteína: temperatura de 38 °C, concentração celular de 35,27 g/L e concentração do indutor IPTG de 0,10 mM resultou em um protocolo de processo que obteve 8,07 g/L de proteína recombinante, valor máximo obtido e validado. / The production of biopharmaceuticals follows an increasing industrial and social interest. Currently there are several types of cancer treatment, however, most of these treatments do not only act on the therapeutic target. A study by researchers at the Butantan Institute identified a protein with anticoagulant and antitumor action, encoded by a gene from the salivary glands of the Amblyoma cajennense tick. This gene was inserted into a plasmid and successfully expressed on the bacterium Escherichia coli BL21DE3. Preclinical studies have shown that the in vivo injection of Amblyomin-X reduced the tumor mass formation induced by B16F10 melanoma cells in mice. This work includes the study of the culture conditions to obtain Amblyomin-X protein with the recombinant Escherichia coli strain BL21DE3 in bioreactors. In order to determine the best biosynthesis condition of the recombinant Amblyomin-X protein, a culture strategy was established for the growth stage of the microorganism and three different factors were studied in the post-microbial growth stage, that is, in the biosynthesis stage of the protein: i) the concentration of the IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) inducer at the time of induction of the protein; ii) the culture temperature during the protein biosynthesis step; and iii) the cell concentration at the beginning of the protein biosynthesis step. For the accomplishment of the tests it was proposed an experimental design - central rotational compound design (DCCR) - chosen for the three factors under study and resulted in the conduction of 17 tests. The tests were performed with the proposed conduction strategy, maintaining the value of µ &x between 0.20 and 0.23 h-1 in the fed batch stage, which allowed to reach the desired cellular concentration with the formation of acetic acid in non-inhibitory concentrations. As a result of the experimental design, obtaining the optimum values of the factors for the protein production step: temperature of 38 °C, cell concentration of 35.27 g/L and concentration of the IPTG inductor of 0.10 mM resulted in a process protocol which obtained 8.07 g / L of recombinant protein, maximum value obtained and validated.

Amblyomin-X é um inibidor de serinoprotease do tipo kunitz obtido de uma biblioteca de cDNA das glândulas salivares do carrapato Amblyomma cajannense. Dados preliminares mostraram que a injeção in vivo de Amblyomin-X reduziu a formação de massa tumoral induzida por células de melanoma B16F10 em camundongos. Com base neste dado e na ação de inibidores de serinoproteases sobre a angiogênese, este projeto foi delineado para caracterizar as ações do Amblyomin-X sobre a angiogênese in vivo e sobre funções da célula endotelial in vitro na vigência do fator de crescimento VEGF-A. Os efeitos do Amblyomin-X sobre a cinética de formação de novos vasos na rede microcirculatória in vivo foram investigados no modelo de câmara dorsal em camundongos e na membrana corioalantóica. Empregando cultura de células endoteliais de linhagem de microcirculação (t-End), foram avaliados os efeitos do Amblyomin-X sobre viabilidade e citoproteção celular (anexina e iodeto de propídio - PI), proliferação celular (incorporação do fluoróforo diacetato de carboxi-fluoresceína succinimidil éster) e ciclo celular, além da expressão das moléculas de adesão PECAM-1, ICAM-1, VCAM-1, β1 e β3 integrinas em ensaios de citometria de fluxo. A aderência celular em Matrigel foi quantificada por espectrofotometria, a formação de tubos foi mensurada por microscopia óptica e a expressão gênica das moléculas de adesão PECAM-1, ICAM-1 e VCAM-1 por RT-PCR. Os dados obtidos mostraram que a aplicação tópica do Amblyomin-X (100ng/10µL) reduziu a formação de novos vasos no tecido subcutâneo dorsal de camundongos, quando o tratamento foi iniciado anterior ou concomitantemente, mas não posteriormente ao tratamento ao VEGF (10ng/10µL) e, reduziu a formação de novos vasos na membrana corioalantóica, quando administrado concomitantemente com o VEGF (0,25ng/10µL). O Amblyomin-X não alterou a viabilidade de células t-End (1000ng/mL, 72 horas); inibiu a apoptose e apoptose tardia causada por meio de cultura carenciado (100ng/mL); inibiu a proliferação (10, 100 ou 1000ng/mL de Amblyomin-X, 48 e 72 horas); induziu parada nas fases G1/G0 do ciclo celular; diminuiu a aderência e a formação de tubos das células endoteliais; não alterou a expressão basal de PECAM-1, VCAM-1, ICAM-1, β1 e β3 integrinas, mas reduziu a expressão de PECAM-1, VCAM-1, ICAM-1 induzida pelo VEGF-A. A redução da expressão protéica da PECAM-1 e ICAM-1 parece não ser dependente de ação do Amblyomin-X na expressão gênica, já que os níveis de RNAm não foram afetados pela ação do Amblyomin-X. Em conjunto, os dados obtidos neste trabalho mostram que o Amblyomin-X inibe a formação de novos vasos in vivo, por interferir, possivelmente, em mecanismos relacionados a sinalização da célula endotelial induzida pelo VEGF-A, em especial com a proliferação, adesão , tubulogênese e expressão de moléculas de adesão da família das imunoglobulinas. / Amblyomin-X is a type-kunitz serineprotease inhibitor obtained from a cDNA library of the Amblyomma cajannense salivary glands. Preliminary data showed that in vivo injection of the protein reduced the formation of tumor-induced B16F10 melanoma cells in mice. Based on this data and on actions of serinorpoteases inhibitors on angiogenesis, this project aimed to characterize the actions of Amblyomin-X on angiogenesis in vivo and on in vitro endothelial cells functions in the presence of the growth factor VEGF. The effects of Amblyomin-X on the in vivo formation of microcirculatory new vessels were investigated in the dorsal chamber model in mice and in the chorioallantoic membrane assay. Mice microvascular endothelial cell lineage (t-End) was employed to evaluate the effects of Amblyomin-X on cytoprotection and cell viability (Annexin-V and propidium iodide-PI), cell proliferation (incorporation of the fluorophore fluorescein diacetate carboxy-succinimidil ester), cell cycle, membrane expression of PECAM-1, ICAM-1, VCAM-1, β1 and β3 integrins adhesion molecules using flow cytometry. Cell adhesion was assessed in matrigel by spectrophotometry, the formation of tubes was measured by optical microscopy and adhesion molecules PECAM-1, ICAM-1 and VCAM-1 gene expression was evaluated by RT-PCR. Data obtained showed that topical application of Amblyomin-X (100ng/10µL) reduced the formation of new vessels, only when Amblyomin-X treatment started before or simultaneously to VEGF-A stimulation (10ng/10µL). Amblyomin-X (100ng/10µL) also reduced the formation of new vessels in the chorioallantoic membrane assay, when coadministered with VEGF (0.25ng/10µL). The Amblyomin-X did not alter the viability of t-End (1000ng/mL, 72 hours), inhibited apoptosis and late apoptosis caused by deprivated serum (100ng/mL), inhibited proliferation (10, 100 or 1000ng/mL, 48 and 72 hours), induced G1/G0 arrest in cell cycle phases, decreased the cell adhesion and tube formation (100ng/mL), did not alter the basal expression of PECAM-1, VCAM-1, ICAM-1, β1 or β3 integrin, but reduced the PECAM-1, VCAM-1, ICAM-1 induced by VEGF-A. Impaired PECAM-1 and ICAM-1 expression seems not be dependent on gene expression, as, mRNA levels were not affected by the action of Amblyomin-X. Together, the data obtained shows that the Amblyomin-X inhibits new vessel formation in vivo, by interfering, possibly, with mechanisms related to VEGF-A induced endothelial cell signaling, especially with the proliferation, adhesion, tubulogenesis and expression of adhesion molecules.

Amblyomin-X é um inibidor de serinoprotease do tipo kunitz obtido de uma biblioteca de cDNA das glândulas salivares do carrapato Amblyomma cajannense. Dados preliminares mostraram que a injeção in vivo de Amblyomin-X reduziu a formação de massa tumoral induzida por células de melanoma B16F10 em camundongos. Com base neste dado e na ação de inibidores de serinoproteases sobre a angiogênese, este projeto foi delineado para caracterizar as ações do Amblyomin-X sobre a angiogênese in vivo e sobre funções da célula endotelial in vitro na vigência do fator de crescimento VEGF-A. Os efeitos do Amblyomin-X sobre a cinética de formação de novos vasos na rede microcirculatória in vivo foram investigados no modelo de câmara dorsal em camundongos e na membrana corioalantóica. Empregando cultura de células endoteliais de linhagem de microcirculação (t-End), foram avaliados os efeitos do Amblyomin-X sobre viabilidade e citoproteção celular (anexina e iodeto de propídio - PI), proliferação celular (incorporação do fluoróforo diacetato de carboxi-fluoresceína succinimidil éster) e ciclo celular, além da expressão das moléculas de adesão PECAM-1, ICAM-1, VCAM-1, β1 e β3 integrinas em ensaios de citometria de fluxo. A aderência celular em Matrigel foi quantificada por espectrofotometria, a formação de tubos foi mensurada por microscopia óptica e a expressão gênica das moléculas de adesão PECAM-1, ICAM-1 e VCAM-1 por RT-PCR. Os dados obtidos mostraram que a aplicação tópica do Amblyomin-X (100ng/10µL) reduziu a formação de novos vasos no tecido subcutâneo dorsal de camundongos, quando o tratamento foi iniciado anterior ou concomitantemente, mas não posteriormente ao tratamento ao VEGF (10ng/10µL) e, reduziu a formação de novos vasos na membrana corioalantóica, quando administrado concomitantemente com o VEGF (0,25ng/10µL). O Amblyomin-X não alterou a viabilidade de células t-End (1000ng/mL, 72 horas); inibiu a apoptose e apoptose tardia causada por meio de cultura carenciado (100ng/mL); inibiu a proliferação (10, 100 ou 1000ng/mL de Amblyomin-X, 48 e 72 horas); induziu parada nas fases G1/G0 do ciclo celular; diminuiu a aderência e a formação de tubos das células endoteliais; não alterou a expressão basal de PECAM-1, VCAM-1, ICAM-1, β1 e β3 integrinas, mas reduziu a expressão de PECAM-1, VCAM-1, ICAM-1 induzida pelo VEGF-A. A redução da expressão protéica da PECAM-1 e ICAM-1 parece não ser dependente de ação do Amblyomin-X na expressão gênica, já que os níveis de RNAm não foram afetados pela ação do Amblyomin-X. Em conjunto, os dados obtidos neste trabalho mostram que o Amblyomin-X inibe a formação de novos vasos in vivo, por interferir, possivelmente, em mecanismos relacionados a sinalização da célula endotelial induzida pelo VEGF-A, em especial com a proliferação, adesão , tubulogênese e expressão de moléculas de adesão da família das imunoglobulinas. / Amblyomin-X is a type-kunitz serineprotease inhibitor obtained from a cDNA library of the Amblyomma cajannense salivary glands. Preliminary data showed that in vivo injection of the protein reduced the formation of tumor-induced B16F10 melanoma cells in mice. Based on this data and on actions of serinorpoteases inhibitors on angiogenesis, this project aimed to characterize the actions of Amblyomin-X on angiogenesis in vivo and on in vitro endothelial cells functions in the presence of the growth factor VEGF. The effects of Amblyomin-X on the in vivo formation of microcirculatory new vessels were investigated in the dorsal chamber model in mice and in the chorioallantoic membrane assay. Mice microvascular endothelial cell lineage (t-End) was employed to evaluate the effects of Amblyomin-X on cytoprotection and cell viability (Annexin-V and propidium iodide-PI), cell proliferation (incorporation of the fluorophore fluorescein diacetate carboxy-succinimidil ester), cell cycle, membrane expression of PECAM-1, ICAM-1, VCAM-1, β1 and β3 integrins adhesion molecules using flow cytometry. Cell adhesion was assessed in matrigel by spectrophotometry, the formation of tubes was measured by optical microscopy and adhesion molecules PECAM-1, ICAM-1 and VCAM-1 gene expression was evaluated by RT-PCR. Data obtained showed that topical application of Amblyomin-X (100ng/10µL) reduced the formation of new vessels, only when Amblyomin-X treatment started before or simultaneously to VEGF-A stimulation (10ng/10µL). Amblyomin-X (100ng/10µL) also reduced the formation of new vessels in the chorioallantoic membrane assay, when coadministered with VEGF (0.25ng/10µL). The Amblyomin-X did not alter the viability of t-End (1000ng/mL, 72 hours), inhibited apoptosis and late apoptosis caused by deprivated serum (100ng/mL), inhibited proliferation (10, 100 or 1000ng/mL, 48 and 72 hours), induced G1/G0 arrest in cell cycle phases, decreased the cell adhesion and tube formation (100ng/mL), did not alter the basal expression of PECAM-1, VCAM-1, ICAM-1, β1 or β3 integrin, but reduced the PECAM-1, VCAM-1, ICAM-1 induced by VEGF-A. Impaired PECAM-1 and ICAM-1 expression seems not be dependent on gene expression, as, mRNA levels were not affected by the action of Amblyomin-X. Together, the data obtained shows that the Amblyomin-X inhibits new vessel formation in vivo, by interfering, possibly, with mechanisms related to VEGF-A induced endothelial cell signaling, especially with the proliferation, adhesion, tubulogenesis and expression of adhesion molecules.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:36Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-10-27 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O carcinoma de células renais (CCR) representa atualmente uma patologia de grande interesse clínico. Sua incidência vem aumentando, especialmente os achados acidentais, que hoje representam 50% dos casos novos diagnosticados (23). Por tratar-se de patologia altamente resistente à quimioterapia e radioterapia, seu potencial de cura encontra-se no tratamento cirúrgico, quando em estádios iniciais, órgano-confinados (62). Inúmeros ensaios clínicos foram propostos para tratar tumores localmente avançados ou metastáticos, mas os resultados inconsistentes encontrados na literatura sejam com quimioterapia, imunoterapia, hormonioterapia ou radioterapia demonstram que a pesquisa clínica deverá progredir em outras direções (22). Foi produzida, em nosso laboratório, uma proteína recombinante oriunda de uma biblioteca de cDNA das glândulas salivares do carrapato Amblyomma cajennense, denominada Amblyomin-X, capaz de inibir o fator Xa de coagulação e de induzir a citotoxicidade em diferentes linhagens de células tumorais (24). Neste trabalho foram avaliados os efeitos do Amblyomin-X em culturas de adenocarcinoma de células renais murinas (Renca) e carcinoma de células renais humanas (Caki-1) com diferentes concentrações deste composto. Analisamos a morfologia e viabilidade celular, ciclo celular e o tipo de morte celular induzido pelo tratamento com a proteína. E também foi avaliado o potencial de inibição da atividade proteassômica frente ao tratamento com Amblyomin-X. Os resultados mostraram que as linhagens Caki-1 e Renca são sensíveis ao Amblyomin-X, o qual induz modificações nas características morfológicas e viabilidade celular após 24 e 48 horas de tratamento. Observamos também que houve morte dose e tempo-dependente, modulação das fases G0/G1 e diminuição das fases S e G2/M do ciclo celular e que em altas concentrações de Amblyomin-X, devido ao seu efeito citotóxico, diminui todas as fases do ciclo celular. Em células Caki-1 ocorreu decréscimo dos níveis de Interleucina-6. Os resultados descritos neste trabalho sugerem que o Amblyomin-X induz citotoxidade em células Renca através do mecanismo de Apoptose. Um dos possíveis alvos do Amblyomin-X é o sistema ubiquitina-proteassomo, visto que foi observada a inibição da atividade catalítica do proteassomo do tipo quimiotripsina em células tratadas com Amblyomin-X. / The renal cell carcinoma (RCC) is currently a disease of great clinical interest. Its incidence is increasing, especially the incidental findings, which now represent 50% of new cases diagnosed. Because it is highly resistant to disease chemotherapy and radiotherapy, their potential to cure is the surgical treatment, while in the early stages, organo-confined. Numerous clinical trials have been proposed to treat locally advanced or metastatic tumors, but results are inconsistent in the literature with chemotherapy, immunotherapy, hormone therapy or radiotherapy have shown that clinical research should progress in other directions. It was produced in our laboratory, a recombinant protein originating from a cDNA library of the salivary glands of Amblyomma cajennense called amblyomin-X, capable of inhibiting factor Xa coagulation and induce cytotoxicity in different tumor cell lines. This study evaluated the effects of Amblyomin-X in cultured murine renal cell adenocarcinoma (Renca) and human renal cell carcinoma (Caki-1) at different concentrations (0.15 to 1.5 ƒÝM) of this compound. We analyze the morphology and cell viability, cell cycle and the type of cell death induced by treatment with the protein. It also evaluated the potential of proteasome inhibition of the activity front in dealing with Amblyomin-X. Then determine that the strains Caki-1 and Renca are sensitive to Amblyomin-X, which induces changes in morphology and cell viability after 24 and 48 hours of treatment with Amblyomin-X. We also observed that death was dose-dependent and time-dependent, inducing a decrease in all phases of the cell cycle and decreased levels of IL-6. The results described herein suggest that the Amblyomin-X induces cytotoxicity in Renca cells through the mechanism of apoptosis. One of the possible targets of Amblyomin-X is the ubiquitin-proteasome system, as was also observed inhibition of catalytic activity of the proteasome chymotrypsin type. / FAPESP: 08/52338-7 / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações