Orientador: Antonio Roberto Siviero / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Civil, Arquitetura e Urbanismo / Made available in DSpace on 2018-08-11T08:58:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marrara_AdrianaCristinaTomasin_D.pdf: 2324347 bytes, checksum: 90d9fc52b09d0b220446678c85e65f25 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A água é um recurso finito e essencial para todas as formas de vida. Estudos demonstram que diversas doenças podem ser causadas por água contaminada. A crescente urbanização e as atividades antrópicas agravam os níveis de poluição dos corpos d¿água. A bacia do ribeirão Tatu cobre grande parte da área urbana do município de Limeira-SP. Nasce na zona rural do município de Cordeirópolis e deságua no rio Piracicaba. Segundo a Resolução CONAMA 357/2005, o ribeirão é considerado classe 4 na área urbana. Possui inúmeros problemas com o lançamento de efluentes domésticos, industriais e agrícolas sem tratamento adequado, poluição urbana e ausência quase total de matas ciliares. O presente trabalho teve por objetivo realizar uma avaliação ecotoxicológica da água superficial e do sedimento do ribeirão Tatu, no período de março de 2005 a março de 2006, utilizando como bioindicadores de toxicidade aguda o microcrustáceo Daphnia similis e de toxicidade crônica o microcrustáceo Ceriodaphnia dúbia. Também, caracterizar a água em relação as variáveis físico-químicas tais como, temperatura, pH, oxigênio dissolvido (OD), condutividade, dureza, alcalinidade, demanda bioquímica de oxigênio (DBO5), demanda química de oxigênio (DQO), determinando para isso, quatro pontos de coleta ao longo do ribeirão. Os resultados demonstraram as áreas com maior vulnerabilidade com relação à toxicidade, havendo maior toxicidade aguda nos pontos 3 e 4 durante todo o período de avaliação.Os resultados da toxicidade crônica apresentaram os mesmos pontos como os mais afetados por este parâmetro. No mês de junho e julho de 2005 ocorreu queda na qualidade da água do ribeirão, que provavelmente pode estar relacionada a substâncias tóxicas presentes na água por lançamento de efluentes industriais sem tratamento adequado. Com relação as analises físico-químicas da água, a temperatura e o pH estiveram dentro dos padrões aceitáveis pela legislação. O OD diminui a medida que o ribeirão avança para área urbana, caracterizando assim, o aumento da poluição. Os maiores valores de condutividade, dureza foram verificados nos pontos 3 e 4, tais valores podem alterar as atividades biológicas dos organismos aquáticos. Com relação aos valores de DBO5 e DQO, estes indicam a possibilidade de descarte de efluentes industriais sem tratamento adequado / Abstract: Water is a finite and essential resource for all life forms. Studies have shown that many illnesses can be caused by contaminated water. The ribeirão Tatu basin comprises much of the urban area of the county of Limeira, SP, Brazil. It originates in the agricultural zone of the county of Cordeirópolis and empties into rio Piracicaba. According to CONAMA Resolution 357/2005, the river has a classification of 4 in urban area. It has countless problems, such as the release of untreated domestic, industrial and agricultural sewage, urban pollution, as well as an almost total absence of riverside woods. The present study carried out an ecotoxicologycal evaluation of the ribeirão Tatu¿s surface water from March of 2005 to March of 2006, using the microcrustacean Daphnia similis as a bioindicator of acute toxicity and the microcrustacean Ceriodaphnia dubia as a bioindicator of chronic toxicity. In addition to this, the water was characterized in relation to physical an chemical variables, such as temperature, pH, dissolved oxygen (OD), conductivity, hardness, alkalinity, biochemical demand of oxygen (DBO5) and chemical demand of oxygen (DQO). For this, four collection points were determined along the watercourse. The results show the most vulnerable areas in relation to toxicity; point 3 and 4 showing greater acute and chronic toxicity. June an July, a drop in the quality of ribeirão Tatu water was recorded, probably due to the presence of toxic substances in the water, due to the release of untreated industrial sewage. The results of the physical-chemical showed acceptable pH and temperature levels. The dissolved oxygen decreases closer to the urban areas, thus indicating an increase in pollution. The conductivity, hardness and alkalinity values were seen in point 3 and 4. Such values may alter biological activities of aquatic organisms. The values for biochemical an chemical demand of oxygen indicates the possibility of the release of industrial sewage without proper treatment / Doutorado / Saneamento e Ambiente / Doutor em Engenharia Civil

Amblyomin-X é um inibidor de serinoprotease do tipo kunitz obtido de uma biblioteca de cDNA das glândulas salivares do carrapato Amblyomma cajannense. Dados preliminares mostraram que a injeção in vivo de Amblyomin-X reduziu a formação de massa tumoral induzida por células de melanoma B16F10 em camundongos. Com base neste dado e na ação de inibidores de serinoproteases sobre a angiogênese, este projeto foi delineado para caracterizar as ações do Amblyomin-X sobre a angiogênese in vivo e sobre funções da célula endotelial in vitro na vigência do fator de crescimento VEGF-A. Os efeitos do Amblyomin-X sobre a cinética de formação de novos vasos na rede microcirculatória in vivo foram investigados no modelo de câmara dorsal em camundongos e na membrana corioalantóica. Empregando cultura de células endoteliais de linhagem de microcirculação (t-End), foram avaliados os efeitos do Amblyomin-X sobre viabilidade e citoproteção celular (anexina e iodeto de propídio - PI), proliferação celular (incorporação do fluoróforo diacetato de carboxi-fluoresceína succinimidil éster) e ciclo celular, além da expressão das moléculas de adesão PECAM-1, ICAM-1, VCAM-1, β1 e β3 integrinas em ensaios de citometria de fluxo. A aderência celular em Matrigel foi quantificada por espectrofotometria, a formação de tubos foi mensurada por microscopia óptica e a expressão gênica das moléculas de adesão PECAM-1, ICAM-1 e VCAM-1 por RT-PCR. Os dados obtidos mostraram que a aplicação tópica do Amblyomin-X (100ng/10µL) reduziu a formação de novos vasos no tecido subcutâneo dorsal de camundongos, quando o tratamento foi iniciado anterior ou concomitantemente, mas não posteriormente ao tratamento ao VEGF (10ng/10µL) e, reduziu a formação de novos vasos na membrana corioalantóica, quando administrado concomitantemente com o VEGF (0,25ng/10µL). O Amblyomin-X não alterou a viabilidade de células t-End (1000ng/mL, 72 horas); inibiu a apoptose e apoptose tardia causada por meio de cultura carenciado (100ng/mL); inibiu a proliferação (10, 100 ou 1000ng/mL de Amblyomin-X, 48 e 72 horas); induziu parada nas fases G1/G0 do ciclo celular; diminuiu a aderência e a formação de tubos das células endoteliais; não alterou a expressão basal de PECAM-1, VCAM-1, ICAM-1, β1 e β3 integrinas, mas reduziu a expressão de PECAM-1, VCAM-1, ICAM-1 induzida pelo VEGF-A. A redução da expressão protéica da PECAM-1 e ICAM-1 parece não ser dependente de ação do Amblyomin-X na expressão gênica, já que os níveis de RNAm não foram afetados pela ação do Amblyomin-X. Em conjunto, os dados obtidos neste trabalho mostram que o Amblyomin-X inibe a formação de novos vasos in vivo, por interferir, possivelmente, em mecanismos relacionados a sinalização da célula endotelial induzida pelo VEGF-A, em especial com a proliferação, adesão , tubulogênese e expressão de moléculas de adesão da família das imunoglobulinas. / Amblyomin-X is a type-kunitz serineprotease inhibitor obtained from a cDNA library of the Amblyomma cajannense salivary glands. Preliminary data showed that in vivo injection of the protein reduced the formation of tumor-induced B16F10 melanoma cells in mice. Based on this data and on actions of serinorpoteases inhibitors on angiogenesis, this project aimed to characterize the actions of Amblyomin-X on angiogenesis in vivo and on in vitro endothelial cells functions in the presence of the growth factor VEGF. The effects of Amblyomin-X on the in vivo formation of microcirculatory new vessels were investigated in the dorsal chamber model in mice and in the chorioallantoic membrane assay. Mice microvascular endothelial cell lineage (t-End) was employed to evaluate the effects of Amblyomin-X on cytoprotection and cell viability (Annexin-V and propidium iodide-PI), cell proliferation (incorporation of the fluorophore fluorescein diacetate carboxy-succinimidil ester), cell cycle, membrane expression of PECAM-1, ICAM-1, VCAM-1, β1 and β3 integrins adhesion molecules using flow cytometry. Cell adhesion was assessed in matrigel by spectrophotometry, the formation of tubes was measured by optical microscopy and adhesion molecules PECAM-1, ICAM-1 and VCAM-1 gene expression was evaluated by RT-PCR. Data obtained showed that topical application of Amblyomin-X (100ng/10µL) reduced the formation of new vessels, only when Amblyomin-X treatment started before or simultaneously to VEGF-A stimulation (10ng/10µL). Amblyomin-X (100ng/10µL) also reduced the formation of new vessels in the chorioallantoic membrane assay, when coadministered with VEGF (0.25ng/10µL). The Amblyomin-X did not alter the viability of t-End (1000ng/mL, 72 hours), inhibited apoptosis and late apoptosis caused by deprivated serum (100ng/mL), inhibited proliferation (10, 100 or 1000ng/mL, 48 and 72 hours), induced G1/G0 arrest in cell cycle phases, decreased the cell adhesion and tube formation (100ng/mL), did not alter the basal expression of PECAM-1, VCAM-1, ICAM-1, β1 or β3 integrin, but reduced the PECAM-1, VCAM-1, ICAM-1 induced by VEGF-A. Impaired PECAM-1 and ICAM-1 expression seems not be dependent on gene expression, as, mRNA levels were not affected by the action of Amblyomin-X. Together, the data obtained shows that the Amblyomin-X inhibits new vessel formation in vivo, by interfering, possibly, with mechanisms related to VEGF-A induced endothelial cell signaling, especially with the proliferation, adhesion, tubulogenesis and expression of adhesion molecules.

Amblyomin-X é um inibidor de serinoprotease do tipo kunitz obtido de uma biblioteca de cDNA das glândulas salivares do carrapato Amblyomma cajannense. Dados preliminares mostraram que a injeção in vivo de Amblyomin-X reduziu a formação de massa tumoral induzida por células de melanoma B16F10 em camundongos. Com base neste dado e na ação de inibidores de serinoproteases sobre a angiogênese, este projeto foi delineado para caracterizar as ações do Amblyomin-X sobre a angiogênese in vivo e sobre funções da célula endotelial in vitro na vigência do fator de crescimento VEGF-A. Os efeitos do Amblyomin-X sobre a cinética de formação de novos vasos na rede microcirculatória in vivo foram investigados no modelo de câmara dorsal em camundongos e na membrana corioalantóica. Empregando cultura de células endoteliais de linhagem de microcirculação (t-End), foram avaliados os efeitos do Amblyomin-X sobre viabilidade e citoproteção celular (anexina e iodeto de propídio - PI), proliferação celular (incorporação do fluoróforo diacetato de carboxi-fluoresceína succinimidil éster) e ciclo celular, além da expressão das moléculas de adesão PECAM-1, ICAM-1, VCAM-1, β1 e β3 integrinas em ensaios de citometria de fluxo. A aderência celular em Matrigel foi quantificada por espectrofotometria, a formação de tubos foi mensurada por microscopia óptica e a expressão gênica das moléculas de adesão PECAM-1, ICAM-1 e VCAM-1 por RT-PCR. Os dados obtidos mostraram que a aplicação tópica do Amblyomin-X (100ng/10µL) reduziu a formação de novos vasos no tecido subcutâneo dorsal de camundongos, quando o tratamento foi iniciado anterior ou concomitantemente, mas não posteriormente ao tratamento ao VEGF (10ng/10µL) e, reduziu a formação de novos vasos na membrana corioalantóica, quando administrado concomitantemente com o VEGF (0,25ng/10µL). O Amblyomin-X não alterou a viabilidade de células t-End (1000ng/mL, 72 horas); inibiu a apoptose e apoptose tardia causada por meio de cultura carenciado (100ng/mL); inibiu a proliferação (10, 100 ou 1000ng/mL de Amblyomin-X, 48 e 72 horas); induziu parada nas fases G1/G0 do ciclo celular; diminuiu a aderência e a formação de tubos das células endoteliais; não alterou a expressão basal de PECAM-1, VCAM-1, ICAM-1, β1 e β3 integrinas, mas reduziu a expressão de PECAM-1, VCAM-1, ICAM-1 induzida pelo VEGF-A. A redução da expressão protéica da PECAM-1 e ICAM-1 parece não ser dependente de ação do Amblyomin-X na expressão gênica, já que os níveis de RNAm não foram afetados pela ação do Amblyomin-X. Em conjunto, os dados obtidos neste trabalho mostram que o Amblyomin-X inibe a formação de novos vasos in vivo, por interferir, possivelmente, em mecanismos relacionados a sinalização da célula endotelial induzida pelo VEGF-A, em especial com a proliferação, adesão , tubulogênese e expressão de moléculas de adesão da família das imunoglobulinas. / Amblyomin-X is a type-kunitz serineprotease inhibitor obtained from a cDNA library of the Amblyomma cajannense salivary glands. Preliminary data showed that in vivo injection of the protein reduced the formation of tumor-induced B16F10 melanoma cells in mice. Based on this data and on actions of serinorpoteases inhibitors on angiogenesis, this project aimed to characterize the actions of Amblyomin-X on angiogenesis in vivo and on in vitro endothelial cells functions in the presence of the growth factor VEGF. The effects of Amblyomin-X on the in vivo formation of microcirculatory new vessels were investigated in the dorsal chamber model in mice and in the chorioallantoic membrane assay. Mice microvascular endothelial cell lineage (t-End) was employed to evaluate the effects of Amblyomin-X on cytoprotection and cell viability (Annexin-V and propidium iodide-PI), cell proliferation (incorporation of the fluorophore fluorescein diacetate carboxy-succinimidil ester), cell cycle, membrane expression of PECAM-1, ICAM-1, VCAM-1, β1 and β3 integrins adhesion molecules using flow cytometry. Cell adhesion was assessed in matrigel by spectrophotometry, the formation of tubes was measured by optical microscopy and adhesion molecules PECAM-1, ICAM-1 and VCAM-1 gene expression was evaluated by RT-PCR. Data obtained showed that topical application of Amblyomin-X (100ng/10µL) reduced the formation of new vessels, only when Amblyomin-X treatment started before or simultaneously to VEGF-A stimulation (10ng/10µL). Amblyomin-X (100ng/10µL) also reduced the formation of new vessels in the chorioallantoic membrane assay, when coadministered with VEGF (0.25ng/10µL). The Amblyomin-X did not alter the viability of t-End (1000ng/mL, 72 hours), inhibited apoptosis and late apoptosis caused by deprivated serum (100ng/mL), inhibited proliferation (10, 100 or 1000ng/mL, 48 and 72 hours), induced G1/G0 arrest in cell cycle phases, decreased the cell adhesion and tube formation (100ng/mL), did not alter the basal expression of PECAM-1, VCAM-1, ICAM-1, β1 or β3 integrin, but reduced the PECAM-1, VCAM-1, ICAM-1 induced by VEGF-A. Impaired PECAM-1 and ICAM-1 expression seems not be dependent on gene expression, as, mRNA levels were not affected by the action of Amblyomin-X. Together, the data obtained shows that the Amblyomin-X inhibits new vessel formation in vivo, by interfering, possibly, with mechanisms related to VEGF-A induced endothelial cell signaling, especially with the proliferation, adhesion, tubulogenesis and expression of adhesion molecules.