Orientador: Valéria Cristina Sandrim / Resumo: A pré-eclâmpsia é uma das principais causas de mortalidade e morbidade entre as gestantes no Brasil e em vários países. A fisiopatologia desta doença é complexa e envolve vários processos. Um desses relaciona-se a um status oxidativo, onde há prevalência de produção de radicais livres e/ou redução da atividade antioxidante. Recentemente, vem sendo explorado como terapia em várias doenças o antioxidante resveratrol, presente em grandes quantidades principalmente nas uvas vermelhas. O resveratrol, além de sequestrar espécies reativas de oxigênio e possuir outros mecanismos de ação, atua ativando o fator de transcrição Nrf2 (nuclear factor, erythroid 2-like 2), responsável pela transcrição de diversos genes que promovem a proteção celular através da codificação de enzimas antioxidantes, como a hemeoxigenase (HO-1). Logo, o objetivo desse estudo foi verificar os efeitos do resveratrol sob a via de ativação do Nrf2 e seus genes alvos em modelo in vitro de pré-eclâmpsia. Esse modelo consiste na incubação de plasma/soro de pacientes pré-eclâmpticas em células endoteliais a fim de se mimetizar a disfunção endotelial característica dessa síndrome. Além disso, foi feito um estudo clínico piloto em que gestantes pré-eclâmpticas beberam suco de uva de forma aguda e tiveram o soro coletado após 1 hora da ingestão para incubação nas células endoteliais. Concluímos que há um potencial de uso do resveratrol na prevenção e tratamento da pré-eclâmpsia. Considerando ainda o uso do suco de uva a... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Preeclampsia is one of the main causes of mortality and morbidity among pregnant women in Brazil and in several countries. The pathophysiology of this disease is complex and involves several processes. One of these is related to an oxidative status, where there is a prevalence of free radical production and /or reduced antioxidant activity. Recently, the antioxidant resveratrol present in large quantities mainly in red grapes, has been explored as potential therapy in several diseases. Resveratrol, in addition of reactive oxygen species scavenging and acting on other mechanisms of action, acts by activating the transcription factor Nrf2 (nuclear factor, erythroid 2-like 2), responsible for the transcription of several genes that promote cell protection through the coding of antioxidant enzymes, such as heme oxygenase-1 (HO-1). Therefore, the aim of this study was to verify the effects of resveratrol on Nrf2 activation and its target genes in an in vitro model of preeclampsia. This model consists of the incubation of plasma/serum from pre-eclamptic patients in endothelial cells in order to mimic the endothelial dysfunction characteristic of this syndrome. In addition, a pilot clinical study was carried out in which pre-eclamptic pregnant women drank grape juice acutely and had the serum collected after 1 hour of ingestion for incubation in endothelial cells. We conclude that there is a potential use of resveratrol in the prevention and management of preeclampsia. Especially th... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

O endotélio é a camada celular interna dos vasos sanguíneos, responsável pela homeostase vascular. Além disso, é a porta de entrada para as células de defesa frente a um quadro de inflamação. A camada endotelial é alvo de diversos estudos devido ao seu caráter de fácil expansão em cultura, porém sua biologia ainda não é completamente compreendida. Devido à sua localização privilegiada, o endotélio está susceptível a alterações da composição da corrente sanguínea. A melatonina, hormônio produzido ritmicamente pela glândula pineal e de forma não rítmica em diversos outros tecidos, tem propriedade citoprotetora. Diversos estudos já demonstraram que ela atua, por diferentes mecanismos de ação e faixas de concentração, como um mediador anti-inflamatório sobre o endotélio. Segundo a hipótese de trabalho de nosso grupo, o eixo imune-pineal, a glândula pineal e o sistema imunológico se interligam em uma comunicação bidirecional, na qual a produção rítmica de melatonina é inibida frente a um quadro de inflamação para que ocorra a montagem da resposta inflamatória independente da hora do dia. Assim sendo, esta dissertação se baseou na hipótese de que as células endoteliais apresentam um ritmo em sua maquinaria que altere a intensidade de resposta frente a um estímulo inflamatório, e propôs avaliar como a melatonina agiria na regulação desse ritmo. Dessa forma, avaliamos como o tratamento sistêmico com LPS afetaria a produção noturna de melatonina, modulando a reatividade de células endoteliais da microcirculação. Demonstramos que o tratamento com LPS diminui os níveis circulantes deste hormônio e inibe a transcrição gênica da enzima chave, AA-NAT. Na periferia, o tratamento com LPS aumenta a reatividade de células endoteliais independente da hora do dia de administração mesmo após 18 dias em cultura. Este efeito é transiente, pois quando o tratamento é realizado seis horas antes da morte, os parâmetros analisados retornam aos níveis basais. A melatonina, administrada juntamente com LPS, reverte o efeito do LPS sobre as células endoteliais, além de reduzir a concentração plasmática de TNF. Além disso, células endoteliais obtidas de animais mortos à noite possuem menor estado de ativação que células provenientes de animais mortos de dia. De maneira geral, o efeito observado sobre as células endoteliais é inversamente correlacionado com a concentração plasmática de melatonina. Esses dados sugerem que as células endoteliais possuem uma espécie de \"memória celular\", pois armazenam as informações do estado do animal doador mesmo após todos os procedimentos em cultura. Adicionalmente, demonstramos a dinâmica do eixo imune-pineal in vivo. Juntamente, nossos dados permitem concluir que a melatonina prima as células endoteliais, modulando sua reatividade de acordo com a hora do dia e o estado de saúde do animal. / The endothelium is the vascular internal cellular layer, responsible for vascular homeostasis. Additionally, it regulates immune cells entrance during an inflammatory response. The endothelial layer is the focus of many studies due to its facility of culture expansion, but its biology is not yet totally understood. Because of its privileged localization, the endothelium is susceptible to plasma compounds changes. Melatonin, rhythmically produced by pineal gland and in a non rhythm way in others tissues, has citoprotector properties. Many studies have already shown that melatonin acts on endothelium as an anti-inflammatory mediator, through different mechanisms of action and concentrations ranges. Considering our work hypothesis, the immune-pineal axis, that suggests that the pineal gland and immune system are integrated through a bidirectional communication, melatonin rhythm production is inhibited during an injury, permitting the mounting of immune response independently of the hour of the day. This dissertation is based on the hypothesis that endothelial cells presents a rhythm in its machinery that alters the response intensity due to an inflammatory stimuli. We analyzed how LPS systemic treatment affects the melatonin nocturnal production, modulating the endothelial cells reactivity of microcirculation. We demonstrated that LPS treatment reduced plasma melatonin level and inhibited gene transcription of key enzyme, AA-NAT. On the periphery, LPS treatment increased endothelial cells reactivity independently of the hour of the day even after 18 days in culture. This effect was transient, once the parameters analyzed returned to basal levels when the treatment was done six hours before the death. Melatonin administrated together with LPS, reverted LPS effects on the endothelial cells, and also reduced plasma TNF concentration. Endothelial cells obtained from animal killed at nighttime are more activated than cells obtained from animals killed at daytime. Generally, the endothelial cells effects are inversely correlated with plasma melatonin level. These data suggests that endothelial cells have a \"cellular memory\", because they are capable to retain the information of donor animal state even after all culture proceedings. Additionally, we demonstrated the immune-pineal axis dynamics in vivo. All together, our results permit to conclude that melatonin primes the endothelial cells, modulating their reactivity according to the hour of the day and donor animal health.

O endotélio é a camada celular interna dos vasos sanguíneos, responsável pela homeostase vascular. Além disso, é a porta de entrada para as células de defesa frente a um quadro de inflamação. A camada endotelial é alvo de diversos estudos devido ao seu caráter de fácil expansão em cultura, porém sua biologia ainda não é completamente compreendida. Devido à sua localização privilegiada, o endotélio está susceptível a alterações da composição da corrente sanguínea. A melatonina, hormônio produzido ritmicamente pela glândula pineal e de forma não rítmica em diversos outros tecidos, tem propriedade citoprotetora. Diversos estudos já demonstraram que ela atua, por diferentes mecanismos de ação e faixas de concentração, como um mediador anti-inflamatório sobre o endotélio. Segundo a hipótese de trabalho de nosso grupo, o eixo imune-pineal, a glândula pineal e o sistema imunológico se interligam em uma comunicação bidirecional, na qual a produção rítmica de melatonina é inibida frente a um quadro de inflamação para que ocorra a montagem da resposta inflamatória independente da hora do dia. Assim sendo, esta dissertação se baseou na hipótese de que as células endoteliais apresentam um ritmo em sua maquinaria que altere a intensidade de resposta frente a um estímulo inflamatório, e propôs avaliar como a melatonina agiria na regulação desse ritmo. Dessa forma, avaliamos como o tratamento sistêmico com LPS afetaria a produção noturna de melatonina, modulando a reatividade de células endoteliais da microcirculação. Demonstramos que o tratamento com LPS diminui os níveis circulantes deste hormônio e inibe a transcrição gênica da enzima chave, AA-NAT. Na periferia, o tratamento com LPS aumenta a reatividade de células endoteliais independente da hora do dia de administração mesmo após 18 dias em cultura. Este efeito é transiente, pois quando o tratamento é realizado seis horas antes da morte, os parâmetros analisados retornam aos níveis basais. A melatonina, administrada juntamente com LPS, reverte o efeito do LPS sobre as células endoteliais, além de reduzir a concentração plasmática de TNF. Além disso, células endoteliais obtidas de animais mortos à noite possuem menor estado de ativação que células provenientes de animais mortos de dia. De maneira geral, o efeito observado sobre as células endoteliais é inversamente correlacionado com a concentração plasmática de melatonina. Esses dados sugerem que as células endoteliais possuem uma espécie de \"memória celular\", pois armazenam as informações do estado do animal doador mesmo após todos os procedimentos em cultura. Adicionalmente, demonstramos a dinâmica do eixo imune-pineal in vivo. Juntamente, nossos dados permitem concluir que a melatonina prima as células endoteliais, modulando sua reatividade de acordo com a hora do dia e o estado de saúde do animal. / The endothelium is the vascular internal cellular layer, responsible for vascular homeostasis. Additionally, it regulates immune cells entrance during an inflammatory response. The endothelial layer is the focus of many studies due to its facility of culture expansion, but its biology is not yet totally understood. Because of its privileged localization, the endothelium is susceptible to plasma compounds changes. Melatonin, rhythmically produced by pineal gland and in a non rhythm way in others tissues, has citoprotector properties. Many studies have already shown that melatonin acts on endothelium as an anti-inflammatory mediator, through different mechanisms of action and concentrations ranges. Considering our work hypothesis, the immune-pineal axis, that suggests that the pineal gland and immune system are integrated through a bidirectional communication, melatonin rhythm production is inhibited during an injury, permitting the mounting of immune response independently of the hour of the day. This dissertation is based on the hypothesis that endothelial cells presents a rhythm in its machinery that alters the response intensity due to an inflammatory stimuli. We analyzed how LPS systemic treatment affects the melatonin nocturnal production, modulating the endothelial cells reactivity of microcirculation. We demonstrated that LPS treatment reduced plasma melatonin level and inhibited gene transcription of key enzyme, AA-NAT. On the periphery, LPS treatment increased endothelial cells reactivity independently of the hour of the day even after 18 days in culture. This effect was transient, once the parameters analyzed returned to basal levels when the treatment was done six hours before the death. Melatonin administrated together with LPS, reverted LPS effects on the endothelial cells, and also reduced plasma TNF concentration. Endothelial cells obtained from animal killed at nighttime are more activated than cells obtained from animals killed at daytime. Generally, the endothelial cells effects are inversely correlated with plasma melatonin level. These data suggests that endothelial cells have a \"cellular memory\", because they are capable to retain the information of donor animal state even after all culture proceedings. Additionally, we demonstrated the immune-pineal axis dynamics in vivo. All together, our results permit to conclude that melatonin primes the endothelial cells, modulating their reactivity according to the hour of the day and donor animal health.

Diversos estudos, in vivo e in vitro, demonstraram a atividade antitumoral da Crotoxina (CTX), toxina majoritária do veneno de serpente Crotalus durissus terrificus, porém, não foi demonstrada, até o momento, a ação desta toxina sobre eventos envolvidos com a neovascularização, essenciais para o crescimento e sobrevivência do tumor. Assim, neste estudo foi investigado o efeito in vitro da CTX sobre os eventos envolvidos com a angiogênese. A CTX inibiu, principalmente na concentração de 1,2µg/mL, a proliferação, adesão e a morfologia das células endoteliais murinas derivados do hemangioma do timo (t.End.1) sobre as matrizes de laminina, colágeno tipo I e fibronectina, bem como a migração por meio dos modelos de cicatrização (Wound Healing), quimiotaxia (transwell) e a formação de tubos no matrigel 3-D, tanto na presença de meio de cultura como no meio condicionado de célula tumoral. Ainda, a CTX inibiu a distribuição das subunidades v e 2 de integrinas e a polimerização do citoesqueleto de actina, evidenciados em microscopia confocal. Os resultados demonstram, pela primeira vez, que a CTX inibe os principais eventos envolvidos com a angiogênese, podendo contribuir de forma importante para o efeito inibitório da toxina sobre a progressão tumoral. / Several studies, in vivo and in vitro have demonstrated antitumor activity of Crotoxin (CTX), the major toxin of Crotalus durissus terrificus venom. Despite evidence of antitumor action of CTX, was not demonstrated yet the action of this toxin on basic parameters for neovascularization, essential for the growth and survival of the tumor. The formation of new blood vessels is the principal process of angiogenesis and involves adhesion, proliferation and migration of endothelial cells to reach remote targets, assembly of endothelial cells into new capillary tubes. CTX (1.2 µg/mL, for 1 hour incubation), inhibited cell proliferation, adhesion, migration, scratch wound healing and capillary-like tube formation on 3-D matrix of endothelial cells line derived from thymus (t.End.1) evaluated in vitro assay at culture medium or conditioned medium obtained from tumour cells culture. Also, this toxin interfered with the distribution of the integrin subunits 2 and v and with the cytoskeleton rearrangement these cells, evidenced in confocal microscope. Taken together, these results demonstrated for the first time, that CTX inhibits key events involved in the angiogenesis process, and may contribute for inhibitory effect of the toxin on tumor progression.

A CTX estimula, in vivo e in vitro, a capacidade secretória de macrófagos na presença de tumor, acompanhado por significativa diminuição da massa tumoral ou proliferação de células tumorais, respectivamente. Considerando a ação imunomodulatória da CTX, a importância central do macrófago na gênese e progressão tumoral e a participação desta célula no microambiente estromal, a atividade secretória de macrófagos tratados com CTX sobre a angiogênese in vitro foi investigada. Células endoteliais tímicas (t.End.1), quando incubadas na presença de macrófagos tratados com CTX (0,3µg/mL) ou sobrenadantes desses macrófagos apresentaram significativa inibição da proliferação, da adesão aos seus ligantes naturais (colágeno I-10µg/mL; fibronectina-3µg/mL e laminina-10 µg/mL) e do número de células migradas, em modelo de Wound healing, bem como a velocidade de migração, avaliada em Time Lapse. Consequentemente, houve inibição da formação de tubos no matrigel-3D, acompanhada pela diminuição da concentração de VEGF e TNF-. Ainda, o bloqueio dos receptores peptídeo formil (FPRs) aboliu as atividades inibitórias dos macrófagos tratados com a toxina, evidenciando a importância destes receptores para a ação da CTX sobre a atividade antiangiogênica de macrófagos. / CTX stimulates, in vivo and in vitro, the macrophages secretory capacity in the presence of tumor, accompanied by a significant tumor mass reduction and tumor cells or inhibition of the proliferation, respectively. Considering the immunomodulatory action of CTX, the pivotal importance of macrophages in the genesis, tumor progression and in the stromal microenvironment, the macrophages secretory activity treated with CTX on angiogenesis was investigated in vitro. Thymic endothelial cells (t.End.1), when incubated in the presence of macrophages treated with CTX (0.3g/ml) or supernatants of these macrophages showed significant inhibition of proliferation, adhesion to its natural ligands (Type I collagen-10mg/ml ; fibronectin-3g/ml and laminin-10/mL), and of the cell number migrated in Wound healing model as well as the cell migration velocity, evaluated in Time Lapse. Consequently, there was inhibition of the cappilary-like tube formation on matrigel-3D matrix, accompanied by VEGF and TNF- secretion decrease. Further, the formyl peptide receptor (FPRs) blockade abolished the inhibitory activity of the macrophages treated with the toxin, suggesting the importance of these receptors to the action of CTX on the macrophages antiangiogenic activity.

Orientador: Willian Fernando Zambuzzi / Resumo: Mudanças nas forças tensionais do shear-stress estão associadas a um repertório de cascatas de sinalização celular, as quais modulam em conjunto o fenótipo vascular tornando o tecido endotelial susceptível a variações patofisiológica e, portanto, compreensão do repertório molecular neste cenário é necessária. Com este propósito, nós submetemos células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC) a um circuito de diferentes forças tensionais in vitro, considerando os grupos seguintes: 1. condição de fluxo de shear-stress fisiológico (nomeado Normo); 2. fluxo de shear-stress hipertenso (nomeado Hyper), e 3. células do grupo 2 foram retornadas para a condição Normo (nomeado Return). As amostras foram apropriadamente coletadas para seguir em diferentes metodologias. Nossos resultados mostraram um forte envolvimento de c-Src no controle da cascata de mecanotransdução modulando sinalização necessária para o fenótipo de adesão, sobrevivência (PI3K/AKT) e proliferação celulares. Além disso, c-Src parece desenvolver importante papel durante o remodelamento da Matriz Extracelular (MEC), cujo performance de matriz metaloproteinases (MMPs) mostrou mudanças significativas. Além disso, através de análise proteômica, mostramos um forte envolvimento de Heat Shock Protein 70 (HSP70) nas células estressadas de modo Hyper, reduzindo significativamente no grupo Return. Esse resultado levou-nos a investigar o proteassoma 20S como uma alternativa proteolítica intracelular para promover o turnover ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Shear-stress changes are associated with a repertory of signaling cascade, modulating vascular phenotype. As shear stress-related tensional forces might be associated with pathophysiological susceptibility, a more comprehensive molecular map needs to be addressed. Thus, we subjected human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) to a circuit of different tensional forces in vitro considering the following three groups: one in a physiological blood flow shear-stress condition (named Normo), another in which these cells followed to a hypertensive blood flow shear-stress (named Hyper), and finally one that these hyper-stressed cells were returned to Normo condition (named Return). The samples were properly collected to allow different methodologies analysis. Our data showed a pivotal involvement of c-Src on driving the mechanotransduction cascade by modulating signaling related with adhesion, survival (PI3K/Akt) and proliferative phenotype. Moreover, c-Src seems to develop important role during Extracellular Matrix (ECM) remodeling, which showed significative changes. Additionally, proteomic analysis showed strong involvement of Heat Shock Protein 70 (HSP70) in the hypertensive-stressed cells; it being significantly decreased in Return phenotype. This result prompted us to investigate 20S proteasome as an intracellular proteolytic alternative to promote the turnover of those proteins. Surprisingly, our data reveled significant over expression of sets of proteasome subunit α-typ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

The traffic of T cells, that occur when bone marrow-derived T cell precursors penetrate the thymus, with a phenotype of immature cells, and its subsequent output, as mature cells, depends of the thymic blood vessels that consists mainly of thymic endothelial cells. The expression of ligands and receptors of ECM in thymic endothelial cells, as well as its role in the processes of migration and emigration of the T cells from the thymus remains unclear. Our goal was to evaluated the expression of some of ECM ligands and their respective receptors in the strain of thymic endothelial cells tEnd.1. In addition, we aimed to study the role of the components of the ECM in the tEnd.1 cells and thymocytes interaction. First, it was detected by confocal immunofluorescence the presence of ECM proteins fibronectin and laminin, which were also observed through flow cytometry. The presence of their respective receptors, VLA5 and VLA6, were highlighted by immunoperioxidase and flow cytometry. Assays of adhesion showed that the use of antibodies anti-VLA5 and anti-VLA6 seems to block at least partially, the adhesion of thymocytes to endothelial cells. In addition, the transendothelial migration assay showed less migration in absolute cell number of the thymocytes pre-treated with antibodies anti-receptors of ECM, although this migration was not statistically significant. Finally, when the phenotype of the transmigrated thymocytes was observed, there was not difference in the migration pattern among them. This investigation shows that the thymic endothelial cells are able to express fibronectin and laminin proteins, as well as, their respective receptors VLA5 and VLA6, and suggests that these molecules could participate in the processes of intrathymic lymphocytes migration. / Os precursores das células T sofrem diferenciação e seleção intratímica através das interações com os componentes do microambiente tímico. Este é constituído em sua grande maioria por células epiteliais tímicas (TEC), macrófagos, células dendríticas, fibroblastos e os produtos de secreção dessas células, tais como hormônios, interleucinas e moléculas de matriz extracelular (ECM). O tráfego de células T, que a princípio penetram no timo provenientes da medula óssea, com fenótipo de células imaturas e, a sua posterior saída, como células maduras, depende terminantemente dos vasos sanguíneos que irrigam o órgão. Tais vasos são constituídos principalmente de células endoteliais tímicas. Tendo em vista que a expressão de ligantes e receptores de ECM em células endoteliais tímicas, assim como sua função nos processos de migração e emigração de células T do timo permanece pouco estudada, neste trabalho foi avaliada a expressão de alguns ligantes de ECM e seus respectivos receptores em uma linhagem de células endoteliais tímicas, tEnd.1. Além disso, estudou-se também o papel destes componentes de ECM na interação entre as células tEnd.1 e os timócitos. A princípio, foi detectado por imunofluorescência confocal a presença das proteínas de ECM fibronectina e laminina, que foram também observadas através de citofluorimetria, enquanto a presença de seus respectivos receptores, VLA5 e VLA6, foram evidenciados por imunoperoxidase e citofluorimetria. Ensaios de adesão sugeriram que o uso de anticorpos anti-receptores de ECM, anti-VLA5 e anti-VLA6, inibem pelo menos parcialmente, a adesão de timócitos às células endoteliais tEnd.1. Por fim, ensaios de migração transendotelial demonstraram claramente uma menor migração em números absolutos dos timócitos pré-tratados com anticorpos anti-receptores de ECM, embora essa diminuição não tenha sido estatisticamente significativa. Tomando em conjunto, os dados neste trabalho demonstraram que as células endoteliais tímicas da linhagem tEnd.1 são capazes de expressar tanto ligantes de ECM, como seus respectivos receptores, sugerindo ainda, a participação destas moléculas nos processos de migração de linfócitos intratímicos.

Diversos estudos, in vivo e in vitro, demonstraram a atividade antitumoral da Crotoxina (CTX), toxina majoritária do veneno de serpente Crotalus durissus terrificus, porém, não foi demonstrada, até o momento, a ação desta toxina sobre eventos envolvidos com a neovascularização, essenciais para o crescimento e sobrevivência do tumor. Assim, neste estudo foi investigado o efeito in vitro da CTX sobre os eventos envolvidos com a angiogênese. A CTX inibiu, principalmente na concentração de 1,2µg/mL, a proliferação, adesão e a morfologia das células endoteliais murinas derivados do hemangioma do timo (t.End.1) sobre as matrizes de laminina, colágeno tipo I e fibronectina, bem como a migração por meio dos modelos de cicatrização (Wound Healing), quimiotaxia (transwell) e a formação de tubos no matrigel 3-D, tanto na presença de meio de cultura como no meio condicionado de célula tumoral. Ainda, a CTX inibiu a distribuição das subunidades v e 2 de integrinas e a polimerização do citoesqueleto de actina, evidenciados em microscopia confocal. Os resultados demonstram, pela primeira vez, que a CTX inibe os principais eventos envolvidos com a angiogênese, podendo contribuir de forma importante para o efeito inibitório da toxina sobre a progressão tumoral. / Several studies, in vivo and in vitro have demonstrated antitumor activity of Crotoxin (CTX), the major toxin of Crotalus durissus terrificus venom. Despite evidence of antitumor action of CTX, was not demonstrated yet the action of this toxin on basic parameters for neovascularization, essential for the growth and survival of the tumor. The formation of new blood vessels is the principal process of angiogenesis and involves adhesion, proliferation and migration of endothelial cells to reach remote targets, assembly of endothelial cells into new capillary tubes. CTX (1.2 µg/mL, for 1 hour incubation), inhibited cell proliferation, adhesion, migration, scratch wound healing and capillary-like tube formation on 3-D matrix of endothelial cells line derived from thymus (t.End.1) evaluated in vitro assay at culture medium or conditioned medium obtained from tumour cells culture. Also, this toxin interfered with the distribution of the integrin subunits 2 and v and with the cytoskeleton rearrangement these cells, evidenced in confocal microscope. Taken together, these results demonstrated for the first time, that CTX inhibits key events involved in the angiogenesis process, and may contribute for inhibitory effect of the toxin on tumor progression.

A hidroquinona (HQ) é um composto fenólico obtido a partir da metabolização endógena do benzeno, está presente no cigarro, medicamentos, reveladores fotográficos, alimentos e plantas medicinais. Temos demonstrado que a intoxicação experimental de ratos à HQ compromete a migração de leucócitos para o pulmão na vigência de resposta inflamatória alérgica ou inespecífica. O presente trabalho visou avaliar os efeitos da HQ sobre atividades da célula endotelial e de neutrófilos envolvidas na inflamação. Culturas primárias de células endoteliais da rede microcirculatória obtidas do músculo cremaster de ratos Wistar, machos, foram tratadas com HQ (10 ou 100 µM, 2 horas) e posteriormente incubadas ou não com LPS de E. coli (LPS; 2 µg/mL). Neutrófilos obtidos da cavidade peritoneal de ratos Wistar, 4 horas após a injeção local de glicogênio de ostra (10 mL, 1%) , foram tratados com HQ (5 ou 10 µM, 1 hora) e, em seguida, foram incubados ou não com LPS (5 µg/mL). Células controles receberam volumes equivalentes dos veículos da HQ e do LPS. Os dados obtidos mostram que o tratamento com a HQ não induziu necrose ou apoptose em ambos os tipos celulares; reduziu a produção de NO pela célula endotelial e por neutrófilos, por bloqueio das atividades das óxido nítrico sintases; reduziu a expressão gênica e protéica de TNF-α, IL-6 e IL-1β induzida pelo LPS em neutrófilos, possivelmente decorrente de redução da translocação nuclear do NFκB; por outro lado aumentou a expressão gênica e protéica basal de TNF-α, IL-1β, ICAM-1, PECAM-1 e VCAM-1, bem como a translocação nuclear do NF-κB; reduziu a atividade fagocítica e microbicida de neutrófilos frente a Candida albicans; não afetou a expressão gênica da CYP2E1 em ambos os tipos celulares, mas aumentou a expressão gênica de MPO em neutrófilos. Em conjunto, os dados permitem concluir que a HQ atua diferentemente nos dois tipos de células estudadas, ativando e inibindo propriedades inflamatórias na célula endotelial e nos neutrófilos, respectivamente. É possível as ações sobre os neutrófilos possam contribuir, pelo menos em parte, pela redução da migração celular durante a resposta inflamatória observada após exposição in vivo à HQ. / Hydroquinone (HQ) is a fenolic compound obtained after benzene metabolism, it is a component of cigarette, medicines, photographic developer, and it is also finding in some foods and medicinal herbs. Our research group has been shown that rats in vivo exposed to HQ present impaired leukocyte migration into lung during allergic or non-specific inflammation. In the present study, we investigate the effects of HQ on functional activities of neutrophils and endothelial cells (EC) involved in inflammation. Primary cultured EC was obtained from microcirculatory network of male Wistar rats, and treated with HQ (10 or 100 µM, two hours). After the treatments, EC was incubated in presence or absence of lipopolissacharide of E. coli (LPS; 2 µg/mL). Peritoneal neutrophils obtained four hours after local injection of oyster glycogen (10 mL, 1%) were incubated with HQ (5 or 10 µM, one hour) and in sequence it was incubated in presence or absence of LPS (5 µg/mL) .Control cells were cultured with equivalent volumes of HQ and LPS vehicle. Results obtained showed that treatment with HQ did not induce apoptosis or necrosis in both types of cells; impaired NO production by endothelial cells and neutrophils dependent on blockade of Ca+2-dependent and independent NOS activity; decreased gene and protein expression of TNF-α, IL-6 and IL-1β in neutrophils induced by LPS, possibly due to reduced nuclear translocation of the NF-κB. On the other hand, HQ treatment enhanced basal protein and gene expression of TNF-α, IL-1β , ICAM-1, PECAM-1 and VCAM-1 and the nuclear translocation of NF-κB; impaired Candida albicans phagocytic and killing indexes; did not affect the gene expression of CYP2E1 in both types of cell, but increased the gene expression of MPO in neutrophils. Taken together, results obtained show that HQ acts differently in the two types of cells studied, activating and inhibiting inflammatory properties in endothelial cells and neutrophils, respectively. Actions on neutrophils may contribute, at least in part, on the reduced leukocyte recruitment during in vivo HQ exposure.

Protein malnutrition (PM) causes anemia and leukopenia by reduction of hematopoietic precursors and impaired production of mediators that induce hematopoiesis, as well as structural and ultrastructural changes in the bone marrow (BM) extracellular matrix. Hematopoiesis occurs in the bone marrow (BM) in distinct regions called niches, which modulate the processes of differentiation, proliferation and self-renewal of the hematopoietic stem cell (HSC). The perivascular niche, composed mainly by mesenchymal stem cells (MSC) and endothelial cells (EC), is the major modulator of HSC and its function extends to the migration of mature hematopoietic cells into the peripheral blood through the production of cytokines and growth factors. Thus, our hypothesis is that PM changes the perivascular niche and our objective is to evaluate whether PM affects the modulatory capacity of MSC and EC on hematopoiesis. C57BL/6 male mice were divided into Control and Malnourished groups, which received for 5 weeks, respectively, a normal protein diet (12% casein) and a low protein diet (2% casein). After this period, animals were euthanized, nutritional and hematological evaluations were performed, featuring the PM. We performed leukemic myelo-monoblasts cells transplantation and observed that these cells have a lower proliferation rate and are rather in the cell cycle G0/G1 phases in malnourished mice, indicating that the BM microenvironment is compromised in PM. MSC were isolated, characterized and differentiated in vitro into EC cells, which were evidenced by CD31 and CD144 markers. We performed the quantification of HSC and hematopoietic progenitors, as well as some regulators of proliferation and differentiation, ex vivo and after cultures with MSC or EC. We observed that PM reduces HSC and hematopoietic progenitors ex vivo. In PM, MSC promote increase in HSC and suppress hematopoietic differentiation, whereas ECs induce cell cycle arrest. Additionally, we verified that PM affects granulopoesis by decreasing the expression of G-CSFr in granule-monocytic progenitors. Thus, we conclude that PD compromises hematopoiesis due to intrinsic alterations in HSC, as well as alterations in the medullary perivascular niche. / A desnutrição proteica (DP) provoca anemia e leucopenia decorrente da redução de precursores hematopoéticos e comprometimento da produção de mediadores indutores da hematopoese. A hematopoese ocorre na medula óssea (MO) em regiões distintas chamadas de nichos, que modulam os processos de diferenciação, proliferação e auto renovação da célula tronco hematopoiética (CTH). O microambiente perivascular, composto principalmente por células tronco mesenquimais (CTM) e células endoteliais (CE), é o principal modulador das CTH e sua função se estende até a migração das células hematopoiéticas maduras para o sangue periférico, através da produção de citocinas e fatores de crescimento. Dessa forma, nossa hipótese é que a DP altera o microambiente perivascular e objetivamos avaliar se a DP afeta a capacidade modulatória das CTM e CE sobre a hematopoese. Utilizamos camundongos C57BL/6 machos, divididos em grupos Controle e Desnutrido, sendo que o grupo Controle recebeu ração normoproteica (12% caseína) e o grupo Desnutrido recebeu ração hipoproteica (2% caseína), ambos durante 5 semanas. Após este período, os animais foram eutanasiados, foi realizada a avaliação nutricional e hematológica, caracterizando a DP. Realizamos transplantes de mielomonoblastos leucêmicos e observamos que estas células apresentam menor taxa de proliferação e se encontram em maior quantidade nas fases G0/G1 do ciclo celular em camundongos desnutridos, indicando que o microambiente medular está comprometido. Isolamos CTM, que foram caracterizadas e diferenciadas in vitro em CE, o que foi evidenciado pelos marcadores CD31 e CD144. Quantificamos CTH e progenitores hematopoéticos, bem como reguladores de proliferação e diferenciação, ex vivo e após culturas com CTM ou CE. Observamos que a DP reduz CTH e progenitores hematopoéticos ex vivo. Na DP, as CTM promovem incremento de CTH e suprimem a diferenciação hematopoética, enquanto que as CE induzem parada no ciclo celular. Adicionalmente, observamos que a DP afeta a granulopoese por diminuição da expressão de G-CSFr nos progenitores grânulo-monocíticos. Dessa forma, concluímos que a DP compromete a hematopoese por alterações intrínsecas na CTH, como também por alterações ocasionadas no microambiente perivascular medular.