Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / At the present time, a significant increase of opportunistic fungal infections is observed, mainly in immunocompromised patients. Candidiasis has been the most documented and are often associated with the formation of biofilms. Commercially available antifungal agents are restricted to a small number of drugs when compared to antibacterial agents. These facts, associated with the increase in the resistance frequency of Candida species, demonstrate the need to search for new therapeutic strategies, where natural products stand out. Several works have already demonstrated different biological activities of β-lapachone (naphthoquinone), including antifungal. Thus, the aim of the present study was to evaluate the antifungal potential of β-lapachone on the growth of Candida spp. Resistant to azole derivatives, in planktonic forms and biofilm, as well as to elucidate their possible mechanisms of action. For this, the evaluation of the anti-fungal effect of β-lapachone was performed on 22 strains of Candida spp. Using microdilution in broth. Subsequently, parameters such as cell viability, generation of reactive oxygen species (EROS), mitochondrial damage and phosphatidylserine externalization were evaluated by means of flow cytometric analysis and DNA damage by comet test, contributing to elucidation of the probable mechanism of Β-lapachone action. In addition, a protein expression profile was obtained by proteomic analysis in a representative C. albicans strain after treatment with the compound. And, finally, the cell viability of the biofilms was determined by the tetrazolium salt reduction (MTT) assay. According to the results, β-lapachone presented antifungal activity against strains of Candida spp. Azole resistant, with minimal inhibitory concentration (MIC) ranging from 4 - 16 μg / mL. Β-lapachone altered the permeability of the mitochondrial membrane, increased the intracellular levels of EROS, decreased cell viability in a dose-dependent manner, caused DNA damage and, consequently, led to cell death by apoptosis. Among the proteins identified, some are related to the translation process, energy metabolism, genetic processing and defense against reactive oxygen species. In relation to the biofilm assays, β-lapachone presented an effect on biofilm formed (24 hours), with the C. albicans isolate presenting a 50% reduction in concentrations of 2x MIC, 10x MIC and 50x MIC, while C. tropicalis and C In the concentrations of 10x MIC and 50x MIC (p <0.05). The use of subinhibitory concentrations was able to significantly reduce (p <0.05) the biofilm formation of Candida spp. Therefore, we conclude that β-lapachone is able to inhibit the in vitro growth of Candida spp. Resistant in both planktonic and biofilm forms suggesting that this compound molecule has the potential to act as an antifungal agent with apoptotic activity. / Nos dias atuais, observa-se um aumento significativo das infecÃÃes fÃngicas oportunistas, principalmente em pacientes imunocomprometidos. A candidÃase tem sido a mais documentada e muitas vezes estÃo associadas à formaÃÃo de biofilmes. Os agentes antifÃngicos disponÃveis no mercado sÃo restritos a um pequeno nÃmero de fÃrmacos quando comparados aos agentes antibacterianos. Esses fatos associados ao aumento da frequÃncia de resistÃncia de espÃcies de Candida, demonstram a necessidade de buscar por novas estratÃgias terapÃuticas, onde os produtos naturais se destacam. Diversos trabalhos jà demonstram diferentes atividades biolÃgicas de β-lapachona (naftoquinona), incluindo antifÃngica. Assim, o objetivo do presente trabalho foi avaliar o potencial antifÃngico da β-lapachona sobre o crescimento de Candida spp. resistentes a derivados azÃlicos, nas formas planctÃnicas e biofilme, bem como elucidar os seus possÃveis mecanismos de aÃÃo. Para isso, a avaliaÃÃo do efeito antifÃngico da β-lapachona foi realizada em 22 cepas de Candida spp. utilizando microdiluiÃÃo em caldo. Posteriormente, parÃmetros como viabilidade celular, geraÃÃo de espÃcies reativas de oxigÃnio (EROS), danos na mitocÃndria e externalizaÃÃo de fosfatidilserina foram avaliados por meio de anÃlises de citometria de fluxo e os danos ao DNA pelo teste do cometa contribuindo para elucidaÃÃo do provÃvel mecanismo de aÃÃo da β-lapachona. AlÃm disso, por meio da anÃlise proteÃmica foi obtido um perfil de expressÃo de proteÃnas em uma cepa representativa de C. albicans apÃs tratamento com o composto. E, por fim, a viabilidade celular dos biofilmes foi determinada por meio do ensaio de reduÃÃo do sal de tetrazÃlio (MTT). De acordo com os resultados obtidos, β-lapachona apresentou atividade antifÃngica frente a cepas de Candida spp. resistentes a azÃlicos, com concentraÃÃo inibitÃria mÃnima (CIM) variando entre 4 - 16 μg/mL. β-lapachona alterou a permeabilidade da membrana mitocondrial, aumentou os nÃveis intracelulares de EROS, diminuiu a viabilidade celular de forma dose-dependente, causou danos ao DNA e, consequentemente, conduziu morte celular por apoptose. Dentre as proteÃnas identificadas, algumas estÃo relacionadas com o processo de traduÃÃo, metabolismo energÃtico, processamento genÃtico e de defesa contra espÃcies reativas de oxigÃnio. Em relaÃÃo aos ensaios de biofilmes, β-lapachona apresentou efeito sobre biofilme formado (24 horas), com o isolado de C. albicans apresentando reduÃÃo de 50% nas concentraÃÃes de 2x CIM, 10x CIM e 50x CIM, enquanto C. tropicalis e C. parapsilosis nas concentraÃÃes de 10x CIM e 50x CIM (p < 0,05). O uso de concentraÃÃes subinibitÃrias foi capaz de reduzir significativamente (p < 0,05) a formaÃÃo dos biofilmes de Candida spp. Portanto, conclui-se que β-lapachona à capaz de inibir o crescimento in vitro de Candida spp. resistentes a azÃlicos tanto na forma planctÃnica como em biofilme sugerindo que esta molÃcula composto tem potencial para agir como agente antifÃngico com atividade apoptÃtica.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.teses.ufc.br:11757 |
| Date | 12 July 2016 |
| Creators | CecÃlia Rocha da Silva |
| Contributors | HÃlio Vitoriano Nobre JÃnior, Maria Fatima da Silva Teixeira, Mary Anne Sousa Lima, Teresa Maria de Jesus Ponte Carvalho, Hemerson Iury Ferreira MagalhÃes |
| Publisher | Universidade Federal do CearÃ, Programa de PÃs-GraduaÃÃo em Microbiologia MÃdica, UFC, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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