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Previous issue date: 2015-08-07 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Snake venoms are formed by organic and inorganic compounds and result in a complex
product of biological nature which present as main objectives the detention, death and
the promotion of initial digestion of its prey. In addition, presents a vast potential for
exploration of molecules with pharmaceutical applications. Among organic compounds
protease should be highlighted due its ability to cause changes on hemostatic system.
Snake venoms serine proteases (SVSPs) are a class of proteases that act on different
factors of the coagulation cascade. One SVSPs class is described as thrombin-like
(SVTLEs) by mimicking some thrombin activities and displays coagulant ability in
vitro through the degradation of fibrinogen chains α and/or β. The objectives were (i) to
characterize structurally BpirSP-39 previously isolated from Bothrops pirajai venom
and (ii) to isolate and characterize the first serine protease (SP) of B. brazili. Studies of
this magnitude are justified because they can provide important information on the
involvement of proteins during envenoming, which can contribute to a better
understanding of the mechanisms of action of these enzymes. Primary and tertiary
structures model of both isolated SPs were elucidated. BpirSP-39 presented 224 amino
acids and has high identity when compared to other SVSPs. BbrzSP-32 was obtained
from B. brazili venom after two chromatographic steps (affinity and reverse phase) and
its primary structure showed 240 amino acid residues. Both SPs characterized are
enzymes which may take the SP’s structure of Agkistrodon halys (PDB ID: 4E7N), an
enzyme used as a model for molecular modeling. The enzymes are glycoproteins
globular and monomeric with two α-helices and two barrels formed by sheet-β. BbrzSP-
32 showed 36 kDa of relative molecular mass and its absolute mass was confirmed by
mass spectrometry as 32,520 Da. It present 79.48% identity when compared to other
SVSPs and was able to degrade the α-chain of fibrinogen, in vitro models, and is
considered a SVTLE-A. It showed a dose-dependent activity in the process of
degradation of fibrin networks demonstrating greater specificity for this activity when
compared to its thrombolytic action. BbrzSP-32 demonstrated proteolysis activity on
gelatin and chromogenic substrates for serine proteases and thrombin-like enzymes (S-
2288 and S-2238 respectively), besides having coagulant activity on human plasma.
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After pre-incubation with PMSF and benzamidine the coagulants and proteolytic
activities on S-2288 and S-2238 substrate were reduced. BbrzSP-32 shows stability
against pH and temperature variations, demonstrating optimum activity between 30 and
40 °C and in the pH range 7.5 to 8.5. The enzyme does not induce or interferes with the
clotting washed platelets. When incubated with parasites Trypanosoma cruzi or
Leishmania infantum, promastigotes and the epimastigote forms, respectively, and S.
epidermidis (gram positive-bacteria), the enzyme presented to cytotoxic on
microorganisms, furthermore, was able to reduce the biofilm formation by the bacteria
species. Both SPs present potential biotechnological. / Os venenos de serpentes são constituídos por compostos orgânicos e inorgânicos,
resultando em um produto biológico eficiente e de natureza complexa, que tem como
principais objetivos a imobilização, morte e a promoção da digestão inicial das presas.
Além disso, apresentam um enorme potencial para prospecção de moléculas com
aplicação farmacológica. Dentre os compostos orgânicos destacam-se as proteínas,
principalmente as proteases, pois apresentam capacidade em alterar o sistema
hemostático. As serinoproteases dos venenos de serpentes (SVSPs) pertencem à classe
de proteases que agem sobre diferentes fatores da cascata de coagulação. Uma das
classes de SVSPs é descrita como trombina-símile (SVTLEs) por mimetizar algumas
atividades da trombina, exibindo capacidade coagulante in vitro por intermédio da
degradação das cadeias α e/ou β do fibrinogênio. Os objetivos do trabalho foram (i)
caracterizar estruturalmente a BpirSP-39 isolada previamente do veneno de Bothrops
pirajai e (ii) isolar e caracterizar a primeira serinoprotease (SP) do veneno de B. brazili.
Estudos dessa magnitude justificam-se, pois podem trazer importantes informações
sobre a participação das proteínas durante o envenenamento, podendo auxiliar no
melhor conhecimento sobre os mecanismos de ações destas enzimas. As estruturas
primárias, bem como, os modelos tridimensionais de ambas SPs isoladas foram
elucidados. A BpirSP-39 possui 224 aminoácidos e apresenta elevada identidade com
outras SVSPs. A BbrzSP-32 foi obtida do veneno de B. brazili após duas etapas
cromatográficas (afinidade e fase reversa) e sua estrutura primária apresentou 240
resíduos de aminoácidos. Ambas as enzimas caracterizadas podem assumir a estrutura
da SP de Agkistrodon halys (PDB ID: 4E7N), proteína utilizada como modelo para a
modelagem molecular, sendo glicoproteínas monoméricas globulares com duas α-
hélices e dois barris formados por folhas-β. Com relação à BbrzSP-32, por intermédio
de eletroforese foi obtida a massa molecular relativa (36 kDa), sendo sua massa absoluta
confirmada por espectrometria de massa como 32.520 Da. A BbrzSP-32 possui
identidade de até 79,48% quando comparada a outras SVSPs e foi capaz de, em
modelos in vitro, degradar a cadeia α do fibrinogênio, sendo considerada uma SVTLE11
A. Possui atividade dose dependente no processo de degradação de redes de fibrina,
demonstrando maior especificidade por essa atividade quando comparada à sua ação
trombolítica. Apresenta atividade de proteólise sobre gelatina e substratos
cromogênicos, para serinoproteases e enzimas trombina-símile (S-2288 e S-2238,
respectivamente), além de possuir atividade coagulante sobre o plasma humano. As
atividades de proteólise sobre os substratos S-2288 e S-2238, bem como, coagulantes,
foram reduzidas por PMSF e benzamidina e, em menor proporção por EDTA. A
BbrzSP-32 apresenta relativa estabilidade frente a variações de pH e temperatura,
demonstrando maiores atividades entre 30 e 40 ºC e, em intervalo de pH 7,5 à 8,5. A
enzima não induz ou interfere na coagulação de plaquetas lavadas. Quando incubada
com os parasitos Trypanosoma cruzi e Leishmania infantum, nas formas epimastigota e
promastigota, respectivamente, e bactérias gram-positiva da espécie Staphylococcus
epidermidis, apresentou-se citotóxica sobre os microrganismos, além disso, foi capaz de
reduzir o biofilme formado pela espécie de bactéria. Ambas SPs apresentam potenciais
biotecnológicos.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:http://localhost:tede/5927 |
| Date | 07 August 2015 |
| Creators | Zaqueo, Kayena Delaix, 69-99249-6615 |
| Contributors | ppgbiotec@ufam.edu.br, Stábeli, Rodrigo Guerino |
| Publisher | Universidade Federal do Amazonas - Universidade Federal de Rondônia, Programa de Pós-graduação em Biodiversidade e Biotecnologia da Amazônia Legal - BIONORTE, UFAM - UNIR, Brasil, Instituto de Ciências Biológicas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFAM, instname:Universidade Federal do Amazonas, instacron:UFAM |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 1984485651082134923, 500 |
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