Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) é o causador do cancro de plantas cítricas. Entre os potenciais fatores de virulência codificados por Xac, está o Sistema de Secreção do Tipo IV (T4SS), um grande complexo multiprotéico que atravessa o periplasma e as membranas interna e externa de bactérias Gram-negativas. O T4SS está envolvido com secreção de proteínas e/ou DNA para o meio extracelular ou diretamente no interior da célula do hospedeiro. Este Sistema requer tipicamente 12 proteínas para realizar suas funções: VirB1-VirB11 e VirD4. O T4SS codificado pelo cromossomo de Xac está aparentemente incompleto, devido a não codificar nenhuma proteína com similaridade de seqüência a VirB7. Os objetivos deste trabalho são estudar a estrutura, função e interações das proteínas do T4SS de Xanthomonas. Foram clonados 23 genes que codificam proteínas ou domínios relacionados ao T4SS, e os polipeptídeos foram produzidos de forma recombinante em E. coli. Treze deles foram purificados e submetidos a estudos estruturais, espectroscópicos e de interações proteína-proteína. A estrutura em solução de Xac262224-139 foi resolvida, apresentando uma região N-terminal desenovelada de aproximadamente 30 resíduos e um domínio globular. Este polipeptídeo oligomeriza em troca química rápida na escala de tempo de RMN e o seu N-terminal desenovelado reconhece o domínio C-terminal de VirB9 (VirB9154-255) em troca lenta. Análise de RMN demonstrou que VirB9154-255 possui uma estrutura flexível em solução, sofrendo uma marcante mudança conformacional na presença de Xac262224-139. Ambas proteínas se tornam rígidas após a interação. Xac2622 é o equivalente a VirB7 em Xanthomonas, baseado na localização do seu gene no lócus do T4SS, localização subcelular predita do polipeptídeo codificado e sua interação com VirB9. Porém, diferente de outras proteínas da família VirB7, Xac2622 possui um domínio globular adicional, com topologia e estrutura similares a domínios presentes apenas em proteínas associadas à membrana externa de bactérias Gram-negativas. Nocaute do gene xac2622, contudo, não afetou a virulência de Xac na infecção de plantas de laranja pêra. O domínio enovelado de Xac2622 foi cristalizado, e os cristais obtidos difrataram até uma resolução de 1,0 Å, pertencendo ao grupo espacial C2221. O modelo preliminar possui Rfactor de 0,121 e Rfree de 0,147. Foram obtidos cristais de outras 3 proteínas relacionadas ao T4SS de Xac, porém somente um deles difratou em alta resolução (2,0 Å, pertencendo ao grupo espacial C2). O potencial sinal de secreção pelo T4SS de Xanthomonas é um domínio C-terminal conservado de aproximadamente 115 resíduos, encontrado nos substratos putativos do T4SS. Caracterizamos um destes domínios, presente na proteína Xac2609, e ele é intrinsicamente desestruturado. Essa observação pode ter implicações funcionais, visto que os substratos são desenovelados antes de sua passagem pelo canal de secreção do T4SS / Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) is a gram-negative bacterial phytopathogen that infects citrus. One possible virulence determinant is a chromosomally encoded Type IV Secretion System (T4SS), a multiprotein complex that spans the bacterial periplasm and both inner and outer membranes. The T4SS is used by some bacteria to secrete proteins and/or DNA to the extracellular milieu or the host interior. The model T4SS from Agrobacterium tumefaciens is made up of twelve structural proteins: VirB1-VirB11 and VirD4. The Xanthomonas T4SS is apparently incomplete because of the lack of a polypeptide with sequence similarity to VirB7. The aim of this project is the study of structure-function relationships in the Xanthomonas T4SS. Twenty-three T4SS protein-coding genes, including full-length proteins or domains, were cloned and the proteins were produced in different E. coli strains. Thirteen polypeptides were purified and some of them were submitted to structural, spectroscopic and protein-protein interaction studies. We used NMR to solve the solution structure of Xac262224-139 which consists of an unfolded N-terminal segment of ~30 residues followed by a globular domain. Xac262224-139 oligomerizes in fast exchange at the NMR time scale and interacts via its unfolded N-terminus with the VirB9 C-terminus (VirB9154-255) in slow exchange. NMR analysis showed that VirB9154-255 has a flexible structure in solution. However, this polypeptide undergoes a significant conformational modification in the presence of Xac2622,24-139 and both proteins become rigid upon interaction. Xac2622 is the Xanthomonas VirB7, based on the chromosomal localization of its gene, predicted subcellular localization and protein interaction analysis. But surprisingly, unlike other VirB7 proteins, Xac2622 has an extra C-terminal folded domain whose topology and structure are strikingly similar to that of periplasmic domains found in outer membrane proteins of many bacterial Secretion Systems. Knockout of the xac2622 gene, however, does not affect the Xac virulence in orange leaf infection assays. The Xac2622 folded domain was also crystallized, and these crystals diffracted up to 1.0 Å resolution and belong to the space group C2221. The preliminary refined model has Rfactor of 0.121 and Rfree of 0.147. Crystals of three other T4SS proteins have been obtained, but only one of them diffracted to high resolution (2.0 Å; space group C2). Xac2610 is a hypothetical protein whose gene is located in the T4SS locus, and its interactions were studied with VirB9, VirB11 and Xac2609, a putative T4SS substrate. The potential T4SS secretion signal is a conserved, approximately 115 residues, C-terminal domain found in the putative substrates of the Xanthomonas T4SS. This sequence mediates interactions with VirD4. We have characterized this domain from one substrate and it is mainly unfolded. This observation may have functional implications, as the substrates are unfolded before their secretion through the T4SS channel
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-08112010-092717 |
| Date | 25 May 2010 |
| Creators | Souza, Diorge Paulo de |
| Contributors | Farah, Shaker Chuck |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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