O microrganismo alvo deste estudo pertence ao gênero Naegleria, que compreende amebas de vida livre amplamente distribuídas ao redor do mundo. Estas possuem estratégias de adaptação em condições de temperatura e pH que envolvem a diferenciação das células para as formas flagelada e cística. A via de biossíntese e incorporação do aminoácido selenocisteína (Sec, U) em N. gruberi foi descrita e, devido à incorporação co-traducional deste aminoácido em resposta a um códon UGA em fase de leitura, possui diversos fatores específicos que tornam a via alvo de estudos moleculares. Dentre os genes identificados, destaca-se o de selenofosfato sintetase (SPS), uma proteína funcionalmente dimérica envolvida na catálise da conversão de seleneto e adenosina 5´-trifosfato (ATP) em selenofosfato, essencial à síntese de Sec. Diferindo das SPSs homólogas, em N. gruberi a proteína (NgSPS2) é codificada em fusão N-terminal com uma metiltransferase e totaliza 737 aminoácidos. Esta descoberta motivou os objetivos da pesquisa baseada na investigação celular de NgSPS2 nativa nas três diferentes formas de vida de N. gruberi através de ensaios imunoenzimáticos, e a caracterização bioquímica e biofísica da proteína recombinante. A análise dos resultados obtidos por Western blot indicaram que NgSPS2, in vivo, apresenta os dois domínios metiltransferase e SPS separados após a tradução para uma cultura amebóide e, após alcançar a diferenciação de cada uma das formas isoladamente, este resultado se confirmou também para cistos e flagelados. A investigação de N. gruberi em cultura indica o aumento na atividade da via de síntese de selenoproteínas na presença de selênio conferindo resistência às condições de estresse oxidativo. A caracterização bioquímica do domínio C-terminal de NgSPS2, por cromatografia de exclusão molecular analítica e eletroforese não desnaturante, revelou predominância de dímeros em solução, coerente com SPSs homólogas. Os testes de cristalização não resultaram na obtenção de cristais, porém a proteólise limitada permitiu selecionar tripsina como potencial para a clivagem do N terminal do N terminal flexível. A conservação dos resíduos de aminoácidos funcionais em NgSPS2.CTD e seu comportamento em solução confirmam a obrigatoriedade da união de cada monômero e, por isso o domínio metiltransferase adicional pode ser desfavorável à montagem do dímero e in vivo a fusão é desfeita após a tradução. / The target microorganism of the present study belongs to the Naegleria genus. This genus includes free life amoebas widely distributed around the world that, in order to survive in bad temperature and pH environments, developed an adaptive strategy consisting of cells differentiation to flagellate and cystic form. The biosynthesis and incorporation of selenocysteine amino acid (Sec, U) in N. gruberi has been described and, because of the co-translational incorporation of this amino acid in response to a UGA codon during the reading step, this process has several specific factors which make it a target for molecular studies. Among the identified genes, we can highlight the one which encodes the selenophosphate synthetase that is involved in the catalytic conversion of selenite and adenosine triphosphate into selenium phosphate, a necessary step to the Sec synthesis that uses selenide and ATP to produce selenophosphate. SPS from N.gruberi is encoded with an methyltransferase N-terminal fused with the typical SPS C-terminal domain, an open read frame that contains 2211 nucleotides encoding 737 amino acids. This discovery has motivated the initial aims of this project, based on the cellular investigation of SPS2, native on the three different form lifes of N. gruberi, through immunoenzymatic assays, besides a study with the recombinant protein to clarify the biochemistry and biophysics features of NgSPS2. The results indicated that the protein do not keep both domains fused after the translation process, suggesting that they need to be separated to perform their biological function. The investigation of the N. gruberi culture revealed that the cells become less sensitive to stress agent in the presence of selenium, which seems to be correlated with the increasing activity of the selenoprotein synthesis. The biochemistry characterization of the NgSPS2 C-terminal domain, using size exclusion chromatography and electrophoresis under non-denaturing conditions revealed the predominance of dimers in solution according with the typical homologous SPS oligomeric state. The crystallization tests have not resulted in crystal growth; however, the limited proteolysis may be an alternative to optimize the crystallization process. These studies may enlarge the knowledge about the biosynthesis of Sec. in N. gruberi.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-17092015-105838 |
| Date | 16 July 2015 |
| Creators | Bellini, Natalia Karla |
| Contributors | Thiemann, Otavio Henrique |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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