Orientador: Prof. Dr. Luciano Puzer / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Ciência & Tecnologia - Química, 2014. / Serpina é o nome dado a uma superfamília de proteínas com grande diversidade de funções biológicas, e que tem como principal característica a inibição de serino proteases. Até meados do ano de 2002, acreditava-se que as serpinas eram exclusivas de organismos eucarióticos. No entanto, com o desenvolvimento das técnicas de sequenciamento de genomas, essas proteínas passaram a ser identificadas também em organismos procariotos. Assim com o objetivo de avaliar a capacidade de duas serpinas bacterianas (G. violaceus e M. xanthus) em inibir serino proteases foi realizado nesse trabalho a clonagem, expressão e caracterização bioquímica da atividade inibitória de duas serpinas bacterianas descritas no banco de dados de genoma "genbank". As serpinas que foram alvo de nosso estudo possuem diferentes sequências de aminoácidos na sua RCL (alça do centro reativo), visando produzir serpinas com diferentes especificidades para serino proteases. Os genes codificadores das duas serpinas foram clonados em vetor de expressão pET-28a(+). As serpinas S1 (Gloeobacter violaceus) e S2 (Myxococcus xanthus) foram expressas na cepa bacteriana E. coli Bl21 (D3), purificadas pela técnica de cromatografia de afinidade em resina de níquel Ni-NTA e obtidas na forma solúvel. Foram realizados ensaios para determinar a atividade inibitória das serpinas S1 (G. violaceus) e S2 (M. xanthus) contra as enzimas tripsina, quimotripsina, elastase, subtilisina, NS3 (dengue) e ainda da serpina S1 frente as calicreínas teciduais humanas 1, 3 e 5. A eficiência da reação de inibição da serpina S1 contra essas enzimas também foi testada na presença de glicosaminoglicanos (GAG¿s): heparina, sulfato de dermatan e sulfato de condroitina. A serpina S1 (G. violaceus) apresentou atividade inibitória frente à tripsina na ausência e também na presença dos GAG¿s heparina, sulfato de dermatan e sulfato de condroitina, sendo que na presença de heparina foi possível observar o menor valor de constante de velocidade de segunda ordem (k¿) em relação aos demais GAG¿s testados, sugerindo que a heparina atua de alguma forma na diminuição da velocidade na reação de inibição da tripsina pela serpina S1. Foi possível visualizar a formação do complexo covalente entre a serpina S1 (G. violaceus) e a tripsina por análise em SDS-PAGE 10%. Também analisamos a ação inibitória de compostos sintéticos derivados do isomanídeo frente às calicreínas teciduais humanas 1, 3, 5, 6 e 7. Nesse estudo foi possível obter inibidores seletivos para as calicreínas humanas teciduais 5 e 7, a partir dos compostos sintéticos derivados do isomanídeo e através dos estudos de docking, juntamente com a análise das estruturas das KLK5 e KLK7, foram fornecidas informações sobre as diferenças observadas entre as afinidades de ligação dos diferentes compostos derivados do isomanídeo refletidos nos resultados dos testes de inibição. / Serpin is the name given to the superfamily of proteins with wide range of biological functions, and that has as main feature the inhibition of serine proteases. Until mid-year 2002 it was believed that the serpins were unique to eukaryotic organisms. However, with the development of genome sequencing techniques, these proteins are now also been identified in prokaryotic organisms. Thus, with the objective of evaluate the ability of two bacterial serpins (G. violaceus and M. xanthus) to inhibit serine proteases was performed in this work the cloning, expression and biochemical characterization of the inhibitory activity of two bacterial serpins described in the database of genome "genbank". Serpins that have been the target of our study have different sequences of amino acids in RCL (the reactive center loop), to produce serpins with different specificities for serine proteases. The genes encoding the two serpins were cloned into the expression vector pET-28a (+). S1 (Gloeobacter violaceus) and S2 (Myxococcus xanthus) serpins were expressed in the bacterial strain E. coli BL21 (D3), purified by the technique of affinity chromatography on nickel Ni-NTA resin and obtained in soluble form. Assays were performed to determine the inhibitory activity of serpins S1 (G. violaceus) and S2 (M. xanthus) against the enzymes trypsin, chymotrypsin, elastase, subtilisin, NS3 (dengue) and also the serpin S1 against human tissue kallikrein 1, 3 and 5. The efficiency of the inhibition reaction against these enzymes serpin S1 was also tested in the presence of glycosaminoglycans (GAG's) heparin, dermatan sulfate and chondroitin sulfate. S1 serpin (G. violaceus) had inhibitory activity against trypsin in the absence and presence of GAGs heparin, dermatan sulfate and chondroitin sulfate, and in the presence of heparin was observed the lowest value of the rate constant of the second order (k') compared to the other GAG's tested, suggesting that heparin acts in some way in reducing the speed in inhibiting reaction of trypsin by serpin S1. It was possible to visualize the formation of a covalent complex between S1 (G. violaceus) serpin and trypsin by SDS-PAGE 10% analysis. We also analyzed the inhibitory activity of synthetic compounds derived from isomannide against human tissue kallikrein 1, 3, 5, 6 and 7. In this study it was possible to obtain specific inhibitors for human tissue kallikrein 5 and 7 from synthetic compound derived from the isomannide and through docking studies, together with the analysis of the structures of KLK5 and KLK7, were provided information about the differences between the various binding affinities of compounds derived from isomannide and reflected in the results of the inhibition tests.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:BDTD:76567 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Oliveira, Jocélia Pereira de Carvalho |
| Contributors | Puzer, Luciano, Sasaki, Sergio Daishi, Muri, Estela Maris Freitas, Sperança, Marcia Aparecida |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf, 111 f. : il. |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFABC, instname:Universidade Federal do ABC, instacron:UFABC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | http://biblioteca.ufabc.edu.br/index.php?codigo_sophia=76567&midiaext=69683, http://biblioteca.ufabc.edu.br/index.php?codigo_sophia=76567&midiaext=69684, Cover: http://biblioteca.ufabc.edu.brphp/capa.php?obra=76567 |
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