A família das serino proteases inclui diversas proteínas envolvidas em uma variedade de processos fisiológicos, como digestão protéica, regulação da pressão arterial e da coagulação sanguínea, entre outros. Quando disfuncionais, relacionam-se à condições patológicas graves como trombose vascular, embolismo pulmonar, infarto agudo do miocárdio, isquemia cerebral, bem como com o quadro da hemofilia B, ocasionada pela deficiência de fator IX. A investigação dos mecanismos de ação e a compreensão do funcionamento de serino proteases e de seus inibidores, as serpinas, é essencial para desvendar mecanismos de doenças e para a modelagem de fármacos mais específicos e eficientes. A pesquisa de fármacos anti-trombóticos busca desenvolver produtos capazes de interferir no processo hemostático que pode resultar no grave quadro trombo-embólico. A nitroforina-2 (NP-2), produzida na secreção salivar do inseto barbeiro Rhodnius prolixus, é uma proteína dotada de potente ação anti-hemostática, atuando como um inibidor específico do complexo tenase intrínseco (TF/FVIIa/FIX). Em trabalho anterior, nosso grupo identificou que o fragmento correspondente ao segmento 90-110 de NP-2 possui atividade anticoagulante. Um modelo do complexo fator IXa (fIXa)-NP-2 foi gerado a partir do “docking” do peptídeo de NP-2 na provável região de ligação com fIXa. Este complexo foi usado como ponto de partida para a simulação por dinâmica molecular e refinamento da estrutura. Novos peptídeos foram propostos como o objetivo de gerar estruturas com maior afinidade por fIXa. Identificamos o hexapeptídeo LKEADE como apresentando melhor afinidade por fIXa, o qual sugerimos como “template” para o planejamento racional de fármacos com ação anticoagulante e anti-trombótica. Numa outra vertente de nosso trabalho, estudamos a superfamília de proteínas denominada serpinas (serpins, ou “SERine Protease INhibitors”) que engloba um grande conjunto de proteínas dotadas de estruturas similares e provenientes de vários e distintos organismos. A função inicialmente identificada para as serpinas foi de inibição de serino proteases da coagulação sangüínea; entretanto, muitas serpinas perderam esta função.Nestes estudos foram usados modelos ocultos de Markov para criar modelos e descrições possibilitando classificar as serpinas em relação à sua função biológica. Foram criadas assinaturas para cada grupo: seqüências consenso e padrões de aminoácidos distintos para cada modelo/função correspondente. Um modelo específico para serpinas da coagulação sangüínea foi criado. Para este modelo, foi gerada a expressão regular [IVTLM]-[FLVA]- F-S-P-[VLWYF]-[SG]-[IV] que descreve tal função. Além disso, ela codifica a seqüência de uma importante região envolvida na mudança conformacional e no funcionamento da serpina. Tanto esta seqüência quanto a estrutura secundária correspondente podem ser melhor investigadas, por sugerirem um alvo para inibição ou ativação. / The protein family of serine proteases comprises molecules involved in a wide range of physiological processes, such as regulation of blood pressure and coagulation. Dysfunctional serine proteases are related to pathological conditions such as embolism, heart failure, cerebral ischemia and also hemophilia B (the latter being a consequence of factor IX deficiency). The understanding of serine proteases mechanism of action, as well as of their inhibitors is a key step to the discover and develop new drugs. In the study of homeostasis, the search for anti-thrombotic drugs seek to avoid thrombosis and related conditions. The protein nitrophorin-2 (NP-2), found in the salivary glands of the hematophagous insect Rodnius prolixus, is a specific inhibitor of the intrinsic tenase complex (TF/fVIIa/fIX). In previous studies, we identified the NP-2 fragment (amino acid sequence 90-110) showing anticoagulant activity. Models of the complex factor IXa (fIXa) – NP-2 were created. This complex was used as a starting point for the molecular dynamic simulations and structure refinement. New NP-2 peptides were suggested, in order to achieve higher affinity complexes. We identified the hexapeptide LKEADE as showing higher affinity for fIXa, which we suggest to be used on rational drug design studies for anticoagulant drugs. The superfamily of proteins known as serpins (“Serine Protease Inhibitors”) involve a number of similar structures, found in a wide variety of organisms. Its function was initially identified as an inhibitor of blood clotting serine proteases. However, many serpins have lost that function in the course of natural evolution. Hidden Markov models were then used to create profiles classifying those proteins due to their biological function. We created signatures for each group of functional serpins in the form of consensus sequences and distinct amino acid patterns. A blood clotting-specific model was generated, which has yielded the regular expression [IVTLM]-[FLVA]-F-S-P-[VLWYF]-[SG]-[IV]. Such pattern also codes for a region of the structure involved in an extensive conformational change. The change is related to the activation of the serpin, and, therefore, both pattern and sequence should be investigated. Combined, these information suggest a powerful target for blood clotting inhibition.

A família das serino proteases inclui diversas proteínas envolvidas em uma variedade de processos fisiológicos, como digestão protéica, regulação da pressão arterial e da coagulação sanguínea, entre outros. Quando disfuncionais, relacionam-se à condições patológicas graves como trombose vascular, embolismo pulmonar, infarto agudo do miocárdio, isquemia cerebral, bem como com o quadro da hemofilia B, ocasionada pela deficiência de fator IX. A investigação dos mecanismos de ação e a compreensão do funcionamento de serino proteases e de seus inibidores, as serpinas, é essencial para desvendar mecanismos de doenças e para a modelagem de fármacos mais específicos e eficientes. A pesquisa de fármacos anti-trombóticos busca desenvolver produtos capazes de interferir no processo hemostático que pode resultar no grave quadro trombo-embólico. A nitroforina-2 (NP-2), produzida na secreção salivar do inseto barbeiro Rhodnius prolixus, é uma proteína dotada de potente ação anti-hemostática, atuando como um inibidor específico do complexo tenase intrínseco (TF/FVIIa/FIX). Em trabalho anterior, nosso grupo identificou que o fragmento correspondente ao segmento 90-110 de NP-2 possui atividade anticoagulante. Um modelo do complexo fator IXa (fIXa)-NP-2 foi gerado a partir do “docking” do peptídeo de NP-2 na provável região de ligação com fIXa. Este complexo foi usado como ponto de partida para a simulação por dinâmica molecular e refinamento da estrutura. Novos peptídeos foram propostos como o objetivo de gerar estruturas com maior afinidade por fIXa. Identificamos o hexapeptídeo LKEADE como apresentando melhor afinidade por fIXa, o qual sugerimos como “template” para o planejamento racional de fármacos com ação anticoagulante e anti-trombótica. Numa outra vertente de nosso trabalho, estudamos a superfamília de proteínas denominada serpinas (serpins, ou “SERine Protease INhibitors”) que engloba um grande conjunto de proteínas dotadas de estruturas similares e provenientes de vários e distintos organismos. A função inicialmente identificada para as serpinas foi de inibição de serino proteases da coagulação sangüínea; entretanto, muitas serpinas perderam esta função.Nestes estudos foram usados modelos ocultos de Markov para criar modelos e descrições possibilitando classificar as serpinas em relação à sua função biológica. Foram criadas assinaturas para cada grupo: seqüências consenso e padrões de aminoácidos distintos para cada modelo/função correspondente. Um modelo específico para serpinas da coagulação sangüínea foi criado. Para este modelo, foi gerada a expressão regular [IVTLM]-[FLVA]- F-S-P-[VLWYF]-[SG]-[IV] que descreve tal função. Além disso, ela codifica a seqüência de uma importante região envolvida na mudança conformacional e no funcionamento da serpina. Tanto esta seqüência quanto a estrutura secundária correspondente podem ser melhor investigadas, por sugerirem um alvo para inibição ou ativação. / The protein family of serine proteases comprises molecules involved in a wide range of physiological processes, such as regulation of blood pressure and coagulation. Dysfunctional serine proteases are related to pathological conditions such as embolism, heart failure, cerebral ischemia and also hemophilia B (the latter being a consequence of factor IX deficiency). The understanding of serine proteases mechanism of action, as well as of their inhibitors is a key step to the discover and develop new drugs. In the study of homeostasis, the search for anti-thrombotic drugs seek to avoid thrombosis and related conditions. The protein nitrophorin-2 (NP-2), found in the salivary glands of the hematophagous insect Rodnius prolixus, is a specific inhibitor of the intrinsic tenase complex (TF/fVIIa/fIX). In previous studies, we identified the NP-2 fragment (amino acid sequence 90-110) showing anticoagulant activity. Models of the complex factor IXa (fIXa) – NP-2 were created. This complex was used as a starting point for the molecular dynamic simulations and structure refinement. New NP-2 peptides were suggested, in order to achieve higher affinity complexes. We identified the hexapeptide LKEADE as showing higher affinity for fIXa, which we suggest to be used on rational drug design studies for anticoagulant drugs. The superfamily of proteins known as serpins (“Serine Protease Inhibitors”) involve a number of similar structures, found in a wide variety of organisms. Its function was initially identified as an inhibitor of blood clotting serine proteases. However, many serpins have lost that function in the course of natural evolution. Hidden Markov models were then used to create profiles classifying those proteins due to their biological function. We created signatures for each group of functional serpins in the form of consensus sequences and distinct amino acid patterns. A blood clotting-specific model was generated, which has yielded the regular expression [IVTLM]-[FLVA]-F-S-P-[VLWYF]-[SG]-[IV]. Such pattern also codes for a region of the structure involved in an extensive conformational change. The change is related to the activation of the serpin, and, therefore, both pattern and sequence should be investigated. Combined, these information suggest a powerful target for blood clotting inhibition.

A família das serino proteases inclui diversas proteínas envolvidas em uma variedade de processos fisiológicos, como digestão protéica, regulação da pressão arterial e da coagulação sanguínea, entre outros. Quando disfuncionais, relacionam-se à condições patológicas graves como trombose vascular, embolismo pulmonar, infarto agudo do miocárdio, isquemia cerebral, bem como com o quadro da hemofilia B, ocasionada pela deficiência de fator IX. A investigação dos mecanismos de ação e a compreensão do funcionamento de serino proteases e de seus inibidores, as serpinas, é essencial para desvendar mecanismos de doenças e para a modelagem de fármacos mais específicos e eficientes. A pesquisa de fármacos anti-trombóticos busca desenvolver produtos capazes de interferir no processo hemostático que pode resultar no grave quadro trombo-embólico. A nitroforina-2 (NP-2), produzida na secreção salivar do inseto barbeiro Rhodnius prolixus, é uma proteína dotada de potente ação anti-hemostática, atuando como um inibidor específico do complexo tenase intrínseco (TF/FVIIa/FIX). Em trabalho anterior, nosso grupo identificou que o fragmento correspondente ao segmento 90-110 de NP-2 possui atividade anticoagulante. Um modelo do complexo fator IXa (fIXa)-NP-2 foi gerado a partir do “docking” do peptídeo de NP-2 na provável região de ligação com fIXa. Este complexo foi usado como ponto de partida para a simulação por dinâmica molecular e refinamento da estrutura. Novos peptídeos foram propostos como o objetivo de gerar estruturas com maior afinidade por fIXa. Identificamos o hexapeptídeo LKEADE como apresentando melhor afinidade por fIXa, o qual sugerimos como “template” para o planejamento racional de fármacos com ação anticoagulante e anti-trombótica. Numa outra vertente de nosso trabalho, estudamos a superfamília de proteínas denominada serpinas (serpins, ou “SERine Protease INhibitors”) que engloba um grande conjunto de proteínas dotadas de estruturas similares e provenientes de vários e distintos organismos. A função inicialmente identificada para as serpinas foi de inibição de serino proteases da coagulação sangüínea; entretanto, muitas serpinas perderam esta função.Nestes estudos foram usados modelos ocultos de Markov para criar modelos e descrições possibilitando classificar as serpinas em relação à sua função biológica. Foram criadas assinaturas para cada grupo: seqüências consenso e padrões de aminoácidos distintos para cada modelo/função correspondente. Um modelo específico para serpinas da coagulação sangüínea foi criado. Para este modelo, foi gerada a expressão regular [IVTLM]-[FLVA]- F-S-P-[VLWYF]-[SG]-[IV] que descreve tal função. Além disso, ela codifica a seqüência de uma importante região envolvida na mudança conformacional e no funcionamento da serpina. Tanto esta seqüência quanto a estrutura secundária correspondente podem ser melhor investigadas, por sugerirem um alvo para inibição ou ativação. / The protein family of serine proteases comprises molecules involved in a wide range of physiological processes, such as regulation of blood pressure and coagulation. Dysfunctional serine proteases are related to pathological conditions such as embolism, heart failure, cerebral ischemia and also hemophilia B (the latter being a consequence of factor IX deficiency). The understanding of serine proteases mechanism of action, as well as of their inhibitors is a key step to the discover and develop new drugs. In the study of homeostasis, the search for anti-thrombotic drugs seek to avoid thrombosis and related conditions. The protein nitrophorin-2 (NP-2), found in the salivary glands of the hematophagous insect Rodnius prolixus, is a specific inhibitor of the intrinsic tenase complex (TF/fVIIa/fIX). In previous studies, we identified the NP-2 fragment (amino acid sequence 90-110) showing anticoagulant activity. Models of the complex factor IXa (fIXa) – NP-2 were created. This complex was used as a starting point for the molecular dynamic simulations and structure refinement. New NP-2 peptides were suggested, in order to achieve higher affinity complexes. We identified the hexapeptide LKEADE as showing higher affinity for fIXa, which we suggest to be used on rational drug design studies for anticoagulant drugs. The superfamily of proteins known as serpins (“Serine Protease Inhibitors”) involve a number of similar structures, found in a wide variety of organisms. Its function was initially identified as an inhibitor of blood clotting serine proteases. However, many serpins have lost that function in the course of natural evolution. Hidden Markov models were then used to create profiles classifying those proteins due to their biological function. We created signatures for each group of functional serpins in the form of consensus sequences and distinct amino acid patterns. A blood clotting-specific model was generated, which has yielded the regular expression [IVTLM]-[FLVA]-F-S-P-[VLWYF]-[SG]-[IV]. Such pattern also codes for a region of the structure involved in an extensive conformational change. The change is related to the activation of the serpin, and, therefore, both pattern and sequence should be investigated. Combined, these information suggest a powerful target for blood clotting inhibition.

Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-03-26T13:50:28Z No. of bitstreams: 2 Dissertação_Thâmarah_Completo.pdf: 3630312 bytes, checksum: 254c44fa854f1e011380abdfbfb972af (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-26T13:50:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação_Thâmarah_Completo.pdf: 3630312 bytes, checksum: 254c44fa854f1e011380abdfbfb972af (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012-04-16 / CNPq, FACEPE, CAPES e UFPE / Nasutitermes corniger é uma espécie de cupim-praga que causa danos em diversas construções. Enzimas digestivas possuem várias aplicações biotecnológicas e podem constituir alvos para o controle de insetos. O presente trabalho descreve a detecção das atividades de celulases (endoglucanase, exoglucanase e β-glicosidase), hemicelulases (β- xilosidase, α-L-arabinofuranosidase e β-xilanase), α-amilase, e proteases (tripsina-símile, quimotripsina-símile, calicreína-símile e do tipo queratinase) em extratos de intestino de operários e soldados de N. corniger. As atividades enzimáticas foram avaliadas após incubação dos extratos de intestino em diferentes temperaturas e valores de pH e com lectinas termiticidas de Myracrodruon urundeuva. A adaptabilidade desta espécie de cupins para digerir materiais lignocelulósicos foi evidenciada pelos altos valores de atividade de endoglucanase e β-xilanase. Zimografia para proteases do extrato de operários revelou que polipeptídeos de 22, 30 e 43 kDa hidrolisaram caseína. Efeito de inibidores na atividade enzimática mostrou que serino proteases foram as principais proteases presentes no intestino de operários e soldados. As atividades tripsina-símile e calicreína-símile foram detectadas em maiores níveis. Os resultados dos ensaios de estabilidade frente ao aquecimento e pH revelam a presença de aparatos digestivos distintos entre operários e soldados. As lectinas de M. urundeuva afetaram diferentemente as atividades enzimáticas e sua atividade termiticida pode estar relacionada com a modulação de enzimas digestivas. O presente trabalho é uma etapa inicial no estudo do aparato digestivo de N. corniger e estimula a purificação e avaliação do potencial biotecnológico dessas enzimas.

Orientador: Luciano Puzer / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, 2013

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-06-06T15:07:07Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3732467 bytes, checksum: 247973bf48da051a9a1fe62db84cfc55 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-06T15:07:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3732467 bytes, checksum: 247973bf48da051a9a1fe62db84cfc55 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / A lagarta da soja, Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera), é considerada uma das principais pragas da sojicultura, causando enormes prejuízos devido ao seu ataque. As proteases digestivas desempenham papel importante na fisiologia das larvas e o estudo de inibidores de proteases como agentes de controle de pragas tem recebido atenção contínua. Para a utilização dessa estratégia de controle é necessário conhecer a estrutura dessas enzimas, além de entender as interações químicas com esses inibidores. O uso de programas computacionais são ferramentas úteis para contornarem os problemas relacionados às técnicas de elucidação estrutural e avaliam in silico as principais interações entre as enzimas e os ligantes. Após esse processo a caracterização cinética do complexo enzimático contribuem para a melhor compreensão dos centros ativos e dos mecanismos de ação da enzima. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo realizar a modelagem molecular por homologia das serino-proteases intestinais de A. gemmatalis, avaliar as possíveis interações com peptídeos sintéticos utilizando estudos de docking e propôr um modelo de inibição enzimática das serino-proteases utilizando os peptídeos. As sequências obtidas foram utilizadas na modelagem molecular com o programa I-TASSER. Os três melhores modelos estruturais foram validados através dos parâmetros de C-score e B-factor profile. A análise do C-scoreEC classificou as enzimas como serino-proteases. No estudo de docking, dos sete ligantes testados, somente Gor K, Gor R e Gor 5 apresentaram valores de energia livre de ligação para a formação de complexos estáveis. As principais interações observadas foram em regiões do centro ativo e sítio secundário das enzimas. Para a caracterização cinética utilizando diferentes substratos peptídicos as enzimas foram purificadas por cromotagrafia de afinidade utilizando coluna de p-aminobenzamidina agarose em sistema FPLC. Pelas análises dos parâmetros cinéticos foi possível constatar que as serino-proteases intestinais tripsina- like de Anticarsia gemmatalis têm preferência na hidrólise de substratos contendo arginina na posição P1. Nos estudos de cinética de inibição utilizando os peptídeos sintéticos Gor 3, Gor 4 e Gor 5 em presença do substrato cromogênico L-BApNA observou-se que a inibição é do tipo competitiva linear nas concentrações utilizadas. A melhor Ki foi observada para o peptídeo Gor 5 que apresentou uma inibição mais eficiente em comparação aos peptídeos Gor 3 e Gor 4. No geral, a eficiência na inibição da atividade enzimática está relacionada à capacidade de ligação ao centro ativo da enzima. / The velvetbean caterpillar, Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera), is considered the main pest of soybean culture, causing huge losses due to its attack. Digestive proteases play an important role in the physiology of the larvae and the study of protease inhibitors as pest control agents has received continuous attention. The use of this control strategy requires knowledge of the structure of these enzymes, besides understanding the chemical interactions with those inhibitors. Computer programs are useful tools to overcome problems related to structural elucidation techniques and also evaluate in silico the main interactions between enzymes and ligands. After this process the kinetic characterization of the enzyme complex contribute to a better understanding of the active centers of the enzyme and mechanisms of action. In this context, this study aimed to perform homology modeling of intestinal serine proteases A. gemmatalis, to evaluate possible interactions with synthetic peptides utilizing docking studies and to propose one enzyme inhibition model of serine proteases using peptides. The sequences obtained were used in molecular modeling with I-TASSER program. The top three structural models were validated through the C-score parameters and B-factor profile. Analysis of C-scoreEC ranked enzymes like serine proteases. In the docking study of the seven tested ligands, only Gor K, Gor R and Gor 5 showed binding free energy values for the formation of stable complexes. The main interactions were observed in regions of the active site and secondary site of the enzyme. For kinetic characterization using different peptides substrates the crude extract were purified by affinity cromotagraphy using p-aminobenzamidine agarose column FPLC system. From the analysis of the kinetic parameters was noted that the trypsin-like serine proteases from Anticarsia gemmatalis prefer hydrolyse substrates containing arginine at position P1. In inhibition kinetic studies using synthetic peptides Gor 3, Gor 4 and Gor 5 in the presence of chromogenic substrate L-BApNA was observed that the inhibition is linear competitive in the concentration range used. The best Ki was observed for Gor 5 peptide that showed more efficient inhibition compared to peptides Gor 3 and Gor 4. Overall, the efficient inhibition of enzyme activity is related to the binding capacity to the active center of the enzyme.

As serino proteases participam de diversos processos fisiológicos (tal como o de coagulação) e patológicos. Essas enzimas estão amplamente distribuídas entre as espécies, são também toxinas dos venenos de serpentes, sendo denominadas SVSPs (snake venom serine proteases). Essas SVSPs são multifuncionais e contêm uma tríade catalítica formada pelos aminoácidos HDS. Algumas SVSPs são comercialmente disponíveis, sendo indicadas para o tratamento de infarto do miocárdio, tromboses e embolia pulmonar. No veneno de Crotalus durissus terrificus estão descritas até o momento, apenas duas SVSPs sendo que a mais estudada é a giroxina que representa cerca de 2,5% do veneno total. No presente estudo foi reportado a clonagem de sete serino proteases amplificadas a partir de uma biblioteca de cDNA de glândula de veneno de um único espécime adulto de Crotalus durissus terrificus. Estes clones foram analisados com relação à organização do cDNA, estrutura e prováveis funções. A construção do modelo tridimensional da giroxina permitiu verificar as similaridades com tripsina, trombina e outras SVSPs. A glicosilação e a presença de muitas pontes dissulfetos dificultam a obtenção das SVSP recombinantes na forma solúvel e com atividade, por expressão em E.coli. Assim, neste trabalho foi abordada a expressão em células de mamífero (que realiza as modificações pós-traducionais) com resultados promissores. Para tanto, o peptídeo sinal de Igk, a seqüência madura e a região 3 UTR da giroxina foram clonados no vetor pED, originando um novo vetor (pED-Giro). Este vetor carrega o peptídeo sinal de Igk, o que possibilitou a secreção da giroxina para o meio de cultura. O vetor pED-Giro foi transfectado em células CHO DXB11 dhfr e COS-7. A giroxina foi detectada no extrato total das células COS-7 por western blot e, em seguida, purificada do meio de cultura com coluna de afinidade (Benzamidina Sepharose) e demonstrado sua integridade pelo ensaio de atividade esterásica. / The serine proteases affect several physiological processes (such as the coagulation cascade) and pathological ones. These enzymes are widely distributed beyond the species; they are also toxins from snake venoms and are called SVSPs (snake venom serine proteases). These SVSPs are multifunctional and have a catalytic triad formed by HDS amino acids. Some of them are commercially available for use in clinical treatment for heart attack, tromboses and pulmonary embolism. So far, in Crotalus durissus terrificus venom only two SVSPs are described and gyroxin is considered the most studied SVSP which represents about 2,5% of the total venom. In the present study was reported the cloning of seven serine proteases amplified from a cDNA library of a venomous gland of a single adult specimen from Crotalus durissus terrificus venom. These clones have been analyzed in relation to the cDNA organization, structure and probable functions. The three-dimensional model of the gyroxin made possible the analysis of similarities with trypsin, thrombin and other SVSPs. The glycosylation and many disulfide bonds of the SVSPs make difficult the expression in E.coli to obtain the soluble recombinant toxin with activity. The expression in mammalian cells is very promising, because it is possible to make pos translation modification and to obtain the recombinant toxin secreted to the culture medium. The IgK signal peptide, the mature sequence and 3\'UTR region of gyroxin were cloned in the pED expression vector resulting in a new vector (pED-Giro). This vector carries the Igk signal peptide, which allows the secretion of the protein to the culture medium. The pED-Giro vector was transfected in CHO DXB11 dhfr and COS-7 cells. The gyroxin was detected in COS-7 total extract by western blot and after, purified from the medium culture and its integrity was confirmed by esterase activity assay.

As serino proteases participam de diversos processos fisiológicos (tal como o de coagulação) e patológicos. Essas enzimas estão amplamente distribuídas entre as espécies, são também toxinas dos venenos de serpentes, sendo denominadas SVSPs (snake venom serine proteases). Essas SVSPs são multifuncionais e contêm uma tríade catalítica formada pelos aminoácidos HDS. Algumas SVSPs são comercialmente disponíveis, sendo indicadas para o tratamento de infarto do miocárdio, tromboses e embolia pulmonar. No veneno de Crotalus durissus terrificus estão descritas até o momento, apenas duas SVSPs sendo que a mais estudada é a giroxina que representa cerca de 2,5% do veneno total. No presente estudo foi reportado a clonagem de sete serino proteases amplificadas a partir de uma biblioteca de cDNA de glândula de veneno de um único espécime adulto de Crotalus durissus terrificus. Estes clones foram analisados com relação à organização do cDNA, estrutura e prováveis funções. A construção do modelo tridimensional da giroxina permitiu verificar as similaridades com tripsina, trombina e outras SVSPs. A glicosilação e a presença de muitas pontes dissulfetos dificultam a obtenção das SVSP recombinantes na forma solúvel e com atividade, por expressão em E.coli. Assim, neste trabalho foi abordada a expressão em células de mamífero (que realiza as modificações pós-traducionais) com resultados promissores. Para tanto, o peptídeo sinal de Igk, a seqüência madura e a região 3 UTR da giroxina foram clonados no vetor pED, originando um novo vetor (pED-Giro). Este vetor carrega o peptídeo sinal de Igk, o que possibilitou a secreção da giroxina para o meio de cultura. O vetor pED-Giro foi transfectado em células CHO DXB11 dhfr e COS-7. A giroxina foi detectada no extrato total das células COS-7 por western blot e, em seguida, purificada do meio de cultura com coluna de afinidade (Benzamidina Sepharose) e demonstrado sua integridade pelo ensaio de atividade esterásica. / The serine proteases affect several physiological processes (such as the coagulation cascade) and pathological ones. These enzymes are widely distributed beyond the species; they are also toxins from snake venoms and are called SVSPs (snake venom serine proteases). These SVSPs are multifunctional and have a catalytic triad formed by HDS amino acids. Some of them are commercially available for use in clinical treatment for heart attack, tromboses and pulmonary embolism. So far, in Crotalus durissus terrificus venom only two SVSPs are described and gyroxin is considered the most studied SVSP which represents about 2,5% of the total venom. In the present study was reported the cloning of seven serine proteases amplified from a cDNA library of a venomous gland of a single adult specimen from Crotalus durissus terrificus venom. These clones have been analyzed in relation to the cDNA organization, structure and probable functions. The three-dimensional model of the gyroxin made possible the analysis of similarities with trypsin, thrombin and other SVSPs. The glycosylation and many disulfide bonds of the SVSPs make difficult the expression in E.coli to obtain the soluble recombinant toxin with activity. The expression in mammalian cells is very promising, because it is possible to make pos translation modification and to obtain the recombinant toxin secreted to the culture medium. The IgK signal peptide, the mature sequence and 3\'UTR region of gyroxin were cloned in the pED expression vector resulting in a new vector (pED-Giro). This vector carries the Igk signal peptide, which allows the secretion of the protein to the culture medium. The pED-Giro vector was transfected in CHO DXB11 dhfr and COS-7 cells. The gyroxin was detected in COS-7 total extract by western blot and after, purified from the medium culture and its integrity was confirmed by esterase activity assay.

A lagarta da espécie Lonomia obliqua é medicamente importante, cujo veneno, presente nas espículas, causa uma síndrome hemorrágica caracterizada por equimoses, alterações da coagulação, dentre outros sintomas. Isto sugere a presença de peptídeos bioativos com potencial farmacêutico, devido à capacidade de modular o comportamento das células endoteliais. O objetivo deste estudo é analisar os potenciais efeitos do veneno de Lonomia obliqua na angiogênese. Uma linhagem celular endotelial (HUVEC) foi exposta a diferentes concentrações do extrato de espículas da Lonomia obliqua (Lonomia obliqua Bristle extract - LOBE) 5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL e 50 μg/mL. Empregando citometria de fluxo, observou-se que nenhuma das doses afetou o ciclo celular, viabilidade ou apoptose das células endoteliais após 24h de exposição. Os esferóides das células HUVEC foram plaqueados numa matriz 3D de colágeno e observou-se que LOBE (10 μg/mL, 20 μg/mL e 50 μg/mL) induz um aumento na migração celular, consistente com o processo de angiogênese. A análise da dinâmica da VE-caderina indica que a exposição imediata a LOBE (10 μg/mL) induz um desprendimento da junção célula-célula, o que corrobora com a hemorragia observada nas vítimas de envenenamento. Através de espectrometria de massa, observou-se que LOBE possui vários potenciais peptídeos bioativos. Grupos destes peptídeos foram isolados por fracionamento com metanol a partir do veneno bruto. Os peptídeos presentes, em cada uma das 10 frações, foram caracterizados por espectrometria de massa e foram analisados os efeitos de cada fração sobre a angiogênese. Os resultados sugerem que alguns dos efeitos do envenenamento por Lonomia obliqua são devidos à presença de peptídeos bioativos que modulam o comportamento das células endoteliais. / The caterpillar of the species Lonomia obliqua is medically important, whose venom present in the bristles leads to an hemorrhagic syndrome characterized by ecchymosis, coagulation disorders and others symptoms. This suggests the presence of bioactive peptides with pharmaceutical potencial due to the ability to modulate the behavior of endothelial cells. The aim of this study is to analyze the potential effects of Lonomia obliqua venom on angiogenesis. An endothelial cell line (HUVEC) was exposed to different concentrations (5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL and 50 μg/mL) of Lonomia obliqua bristle extract (LOBE). Using flow cytometry, it was observed that none of the doses affected endothelial cell cycle, cell viability or apoptosis after 24h of exposition. Spheroids of HUVEC cells were plated in a 3D-collagen matrix and it was observed that LOBE (10 μg/mL, 20 μg/mL and 50 μg/mL) induced an increase on cell migration consistent with the angiogenesis process. Analysis of VE-cadherin dynamics indicates that the immediate exposition to LOBE (10 μg/mL) induced a loosening of cell-cell junction, which corroborates with the hemorrhage observed in the victims. By mass spectroscopy, it was observed that LOBE possesses several potentially bioactive peptides. Groups of these peptides were isolated by a methanol-based fractioning of the crude venom. The peptides present in each of the 10 fractions were characterized by mass spectroscopy and it was analyzed the effects of each fraction on angiogenesis. The results suggest that some of the effects of Lonomia obliqua envenomation are due to the presence of bioactive peptides that modulate the behavior of endothelial cells.

Orientador: Prof. Dr. Luciano Puzer / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Ciência & Tecnologia - Química, 2014. / Serpina é o nome dado a uma superfamília de proteínas com grande diversidade de funções biológicas, e que tem como principal característica a inibição de serino proteases. Até meados do ano de 2002, acreditava-se que as serpinas eram exclusivas de organismos eucarióticos. No entanto, com o desenvolvimento das técnicas de sequenciamento de genomas, essas proteínas passaram a ser identificadas também em organismos procariotos. Assim com o objetivo de avaliar a capacidade de duas serpinas bacterianas (G. violaceus e M. xanthus) em inibir serino proteases foi realizado nesse trabalho a clonagem, expressão e caracterização bioquímica da atividade inibitória de duas serpinas bacterianas descritas no banco de dados de genoma "genbank". As serpinas que foram alvo de nosso estudo possuem diferentes sequências de aminoácidos na sua RCL (alça do centro reativo), visando produzir serpinas com diferentes especificidades para serino proteases. Os genes codificadores das duas serpinas foram clonados em vetor de expressão pET-28a(+). As serpinas S1 (Gloeobacter violaceus) e S2 (Myxococcus xanthus) foram expressas na cepa bacteriana E. coli Bl21 (D3), purificadas pela técnica de cromatografia de afinidade em resina de níquel Ni-NTA e obtidas na forma solúvel. Foram realizados ensaios para determinar a atividade inibitória das serpinas S1 (G. violaceus) e S2 (M. xanthus) contra as enzimas tripsina, quimotripsina, elastase, subtilisina, NS3 (dengue) e ainda da serpina S1 frente as calicreínas teciduais humanas 1, 3 e 5. A eficiência da reação de inibição da serpina S1 contra essas enzimas também foi testada na presença de glicosaminoglicanos (GAG¿s): heparina, sulfato de dermatan e sulfato de condroitina. A serpina S1 (G. violaceus) apresentou atividade inibitória frente à tripsina na ausência e também na presença dos GAG¿s heparina, sulfato de dermatan e sulfato de condroitina, sendo que na presença de heparina foi possível observar o menor valor de constante de velocidade de segunda ordem (k¿) em relação aos demais GAG¿s testados, sugerindo que a heparina atua de alguma forma na diminuição da velocidade na reação de inibição da tripsina pela serpina S1. Foi possível visualizar a formação do complexo covalente entre a serpina S1 (G. violaceus) e a tripsina por análise em SDS-PAGE 10%. Também analisamos a ação inibitória de compostos sintéticos derivados do isomanídeo frente às calicreínas teciduais humanas 1, 3, 5, 6 e 7. Nesse estudo foi possível obter inibidores seletivos para as calicreínas humanas teciduais 5 e 7, a partir dos compostos sintéticos derivados do isomanídeo e através dos estudos de docking, juntamente com a análise das estruturas das KLK5 e KLK7, foram fornecidas informações sobre as diferenças observadas entre as afinidades de ligação dos diferentes compostos derivados do isomanídeo refletidos nos resultados dos testes de inibição. / Serpin is the name given to the superfamily of proteins with wide range of biological functions, and that has as main feature the inhibition of serine proteases. Until mid-year 2002 it was believed that the serpins were unique to eukaryotic organisms. However, with the development of genome sequencing techniques, these proteins are now also been identified in prokaryotic organisms. Thus, with the objective of evaluate the ability of two bacterial serpins (G. violaceus and M. xanthus) to inhibit serine proteases was performed in this work the cloning, expression and biochemical characterization of the inhibitory activity of two bacterial serpins described in the database of genome "genbank". Serpins that have been the target of our study have different sequences of amino acids in RCL (the reactive center loop), to produce serpins with different specificities for serine proteases. The genes encoding the two serpins were cloned into the expression vector pET-28a (+). S1 (Gloeobacter violaceus) and S2 (Myxococcus xanthus) serpins were expressed in the bacterial strain E. coli BL21 (D3), purified by the technique of affinity chromatography on nickel Ni-NTA resin and obtained in soluble form. Assays were performed to determine the inhibitory activity of serpins S1 (G. violaceus) and S2 (M. xanthus) against the enzymes trypsin, chymotrypsin, elastase, subtilisin, NS3 (dengue) and also the serpin S1 against human tissue kallikrein 1, 3 and 5. The efficiency of the inhibition reaction against these enzymes serpin S1 was also tested in the presence of glycosaminoglycans (GAG's) heparin, dermatan sulfate and chondroitin sulfate. S1 serpin (G. violaceus) had inhibitory activity against trypsin in the absence and presence of GAGs heparin, dermatan sulfate and chondroitin sulfate, and in the presence of heparin was observed the lowest value of the rate constant of the second order (k') compared to the other GAG's tested, suggesting that heparin acts in some way in reducing the speed in inhibiting reaction of trypsin by serpin S1. It was possible to visualize the formation of a covalent complex between S1 (G. violaceus) serpin and trypsin by SDS-PAGE 10% analysis. We also analyzed the inhibitory activity of synthetic compounds derived from isomannide against human tissue kallikrein 1, 3, 5, 6 and 7. In this study it was possible to obtain specific inhibitors for human tissue kallikrein 5 and 7 from synthetic compound derived from the isomannide and through docking studies, together with the analysis of the structures of KLK5 and KLK7, were provided information about the differences between the various binding affinities of compounds derived from isomannide and reflected in the results of the inhibition tests.