FONSECA, Thiago de Sousa. Sínteses quimioenzimáticas dos fármacos (R)-luliconazol, (R)-clorprenalina e análogos e síntese química de substâncias imidazólicas. 2017. 210 f. Tese (Doutorado em Química)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by José Orlando Soares de Oliveira (orlando.soares@bol.com.br) on 2017-08-24T13:18:12Z No. of bitstreams: 1 2017_dis_tsfonseca.pdf: 6070980 bytes, checksum: 5c887eadfe845e797a622899c103c8ae (MD5) / Rejected by Weslayne Nunes de Sales (weslaynesales@ufc.br), reason: O trabalho precisa ser normalização. Devolver o trabalho para o aluno para que ele realize as correções. Para acesso ao guia: http://www.biblioteca.ufc.br/publicacoes/41-guia-de-normalizacao Para acesso aos templates: http://www.biblioteca.ufc.br/educacao-de-usuarios/1234-templates Retirar a numeração dos elementos pré-textuais. Eles são contados, mas não são numerados. Refazer a folha de aprovação, conforme modelo estabelecido no Guia de Normalização da UFC e template. Inserir palavras-chave no resumo e no abstract. Listas de figuras, tabelas, esquemas, gráficos, abreviaturas e sumário devem ser digitados com espaçamento 1,5 entrelinhas Retirar as folhas que contém indicação de capítulo e título. Todo o texto deve ser digitado na cor preta, exceto as ilustrações. on 2017-08-24T13:54:08Z (GMT) / Submitted by José Orlando Soares de Oliveira (orlando.soares@bol.com.br) on 2017-08-25T14:00:14Z No. of bitstreams: 1 2017_dis_tsfonseca (2).pdf: 4652909 bytes, checksum: 36641c5931a41c244cc0594e09e74d0e (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-08-30T21:27:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_dis_tsfonseca (2).pdf: 4652909 bytes, checksum: 36641c5931a41c244cc0594e09e74d0e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-30T21:27:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_dis_tsfonseca (2).pdf: 4652909 bytes, checksum: 36641c5931a41c244cc0594e09e74d0e (MD5) Previous issue date: 2017 / The preparation of the antifungal (R)-luliconazole (R-1) and β-agonist (R)-cloroprenaline (R-12 a) drugs and analogues (R-12 b-j) had as key step the preparation of β-halohydrins and β-haloacetates chiral, via kinetic resolution of the corresponding racemic acetates, mediated by lipase. The rac-2-chloro-1-(2,4-dichlorophenyl)ethyl acetate, rac-4 or rac-11 b was used as the "template" substrate to establish the ideal conditions for kinetic resolution via hydrolysis. Through the screening of commercial lipases, were selected the C. antarctica type B, CAL-B, immobilized on acrylic resin (Novozym 435®) and T. lanuginosus (TLL) immobilized on immobead-150, leading to the c values of 50%, e.e.s e e.e.p >92% and E of 185 and 128, respectively. Were evaluated: reaction time, temperature, enzyme/substrate ratio, pH, absence or presence of cosolvents and enzyme reuse. CAL-B was more efficient than TLL, requiring a lower enzyme/substrate ratio (0.5:1) and presenting high activity and selectivity in up to 5 cycles reactions. The best conditions for the resolution of rac-4 were the use of PO43- buffer (pH 7) in the absence of cosolvents, 15 min reaction at 45 °C, leading to c = 50%, e.e.s e e.e.p >99% and E >200. These conditions were used to resolve acetate rac-11 a, which leads to the intermediate in the synthesis of (R)-12 a as well β-haloacetates rac-11 b-j, leading to the analogous (R)-12 b-j. Adjustments in the reaction times were performed (4 h - 9 d) so that the values of c close to 50%. The esters rac-11 a-j were resolved with c ≈ 50%, values of e.e.s and e.e.p = 92 - >99% and E >200. The influence of the esters’ substituents in the time of the kinetic resolution was analyzed considering the steric and electronic effects and evoking the fitting model induced substrate-enzyme with the presence of the hydrophobic pockets. Finally, starting from (S)-2-chloro-1- (2,4-dichlorophenyl)ethanol, (S)-3, (R)-1 was obtained in 43% yield. In order to achieve an atomic economy, we converted the (S)-halohydrins (S)-10 a-j into the respective (R)-acetates (R)-11 a-j via the Mitsunobu reaction, yields ranging from 78-89%. (R)-11 a-j were transformed into the (R)-epoxides (R)-34 a-f; h-j in yields from 68-75% and (R)-11 g was transformed into (R)-halohydrin (R)-10 g in 60% yield. Subsequently, (R)-34 a-f; h-j and (R)-10 g reacted with isopropilamine, yielding (R)-12 a in 71% yield and the analogs (R)-12 b-j in yields 71-80%. Lastly, four imidazole derivatives with yields 72-90% were synthesized, and 1-phenacylimidazole (13) showed antifungal activity against phytopathogenic fungus Fusaruim sacchari, besides the anticorrosive activity for carbon steel. / A preparação dos fármacos antifúngico (R)-luliconazol (R-1) e do β-agonista (R)-clorprenalina (R-12 a) e análogos (R-12 b-j) tiveram como etapa chave a obtenção de β-haloidrinas e β-haloacetatos quirais, via resolução cinética dos correspondentes acetatos racêmicos, mediada por lipase. O rac-acetato de 2-cloro-1-(2,4-diclorofenil)etila, rac-4 ou rac-11 b, foi utilizado como substrato “modelo” para estabelecer as condições ideais para a resolução cinética, via hidrólise. Através da triagem de lipases comerciais, foram selecionadas a C. antarctica do tipo B, CAL-B, imobilizada em resina acrílica (Novozym 435®) e a T. lanuginosus imobilizada em immobead-150 (TLL), as quais levaram a valores de c = 50%, e.e.s e e.e.p >92% e E = 185 e 128, respectivamente. Foram avaliados: tempo reacional, temperatura, razão enzima/substrato, pH, ausência ou presença de cossolventes e reuso das enzimas. A CAL-B foi mais eficiente que a TLL, requerendo uma menor razão enzima/substrato (0,5:1) e apresentando alta atividade e seletividade em até 5 ciclos reacionais. As melhores condições para a resolução de rac-4 foi em tampão PO43- (pH 7) sem cossolventes, 15 min de reação a 45 °C, levando a c = 50%, e.e.s e e.e.p >99% e E >200. Tais condições foram utilizadas para resolver o acetato rac-11 a que leva ao intermediário na síntese da (R)-12 a, bem como dos β-haloacetatos rac-11 b-j, que levam aos análogos (R)-12 b-j. Ajustes nos tempos reacionais foram realizados (4 h - 9 d) para que os valores de c fossem ≈ 50%. Os ésteres rac-11 a-j foram resolvidos com c ≈ 50%, valores de e.e.s e e.e.p = 92 - >99% e E >200. A influência dos substituintes dos referidos ésteres no tempo da resolução cinética foi analisada considerando os efeitos estérico e eletrônico e evocando o modelo do encaixe induzido substrato-enzima com a presença dos bolsões hidrofóbicos. Finalmente, partindo do (S)-2-cloro-1-(2,4-diclorofenil)etanol, (S)-3, foi possível obter o (R)-1 com 43% de rendimento. Objetivando uma economia atômica, convertemos as (S)-haloidrinas (S)-10 a-j nos respectivos (R)-acetatos (R)-11 a-j, via reação de Mitsunobu, com rendimentos de 78-89%. (R)-11 a-f; h-j foram transformados nos (R)-epóxidos (R)-34 a-f; h-j com rendimentos de 68-75% e o (R)-11 g foi transformado na (R)-haloidrina (R)-10 g com 60% de rendimento. Subsequentemente, (R)-34 a-f; h-j e (R)-10 g reagiram com isopropilamina, levando a (R)-12 a com rendimento de 78% e análogos (R)-12 b-j com rendimentos de 71-80%. Por último, foram sintetizados quatro derivados imidazólicos com rendimentos de 72-90%, sendo que o 1-fenacilimidazol (13) apresentou atividade antifúngica frente ao fungo fitopatogênico Fusaruim sacchari, além da atividade anticorrosiva para o aço carbono.

FONSECA, T. S. Síntese quimioenzimática do Mesilato de Rasagilina (Azilect). 2013. 114 f. Dissertação (Mestrado em Química) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013. / Submitted by Daniel Eduardo Alencar da Silva (dealencar.silva@gmail.com) on 2014-11-28T20:39:54Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_tsfonseca.pdf: 1927032 bytes, checksum: 84f632bf5ae2356bf2323decdf5dbfd2 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-11-26T20:28:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_tsfonseca.pdf: 1927032 bytes, checksum: 84f632bf5ae2356bf2323decdf5dbfd2 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-26T20:28:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_tsfonseca.pdf: 1927032 bytes, checksum: 84f632bf5ae2356bf2323decdf5dbfd2 (MD5) Previous issue date: 2013 / Here we describe the synthesis of the chemoenzymatic Rasagilina mesylate (Azilect®), a drug used in monotherapy in patients with early stage Parkinson. One of the goals of this project was to carry out the introduction of chirality via biocatalysis processes. We studied two strategies: i) bioreduction of indanone in the presence of a series of yeast and ii) kinetic resolution of rac-indanol using lipases in organic solvent. In strategy (i) was conducted a screening with six yeasts. In all tests the (S)-indanol was obtained in low conversions (9.4 to 13.2%) and enantiomeric excesses of up to 97.6%. Due to low conversion rates, we decided to implement the strategy (ii). After screening of nine commercial lipases, was possible to verify that the Amano lipase AK from Pseudomonas fluorescens and Lipase from Thermomyces lanuginosus immobilized on immobead-150 were the most efficient in the kinetic resolution of rac- indanila acetate in aqueous medium with enantiomeric ratio equals 111.0 and 167.0 respectively. Thus, such lipases were selected for the kinetic resolution of rac-indanol in organic media. The best results of enzyme activity and selectivity were obtained using hexane as a solvent, reaction time of 15 minutes and 30ºC for Amano lipase AK (free enzyme) and 35ºC for Thermomyces lanuginosus, with enantiomeric ratio equals 200 for both cases. Were held assets of Amano AK (free enzyme) in various media and the best results were obtained selectivity and activity in hexane as organic solvent, reaction time of 6 hours and 30 º C using Amano Lipase AK immobilized chitosan in 2.5% low molecular weight; sodium alginate 2.5% and Amano AK lipase immobilized on chitosan 5.0% low molecular weight. The study was conducted reuse of immobilized lipase, Thermomyces lanuginosus being immobilized on immobead-150, the more efficiently compared to the others, since it has provided excellent results in higher reaction cycles. Subsequently, using a Mitsunobu reaction, (S)-indanol was converted to (R)-azidoindano with 70% yield. Then, the (R)-azidoindano was subjected to Staudinger reaction, producing (R)-indanamine in 60% yield. / Neste trabalho descrevemos a síntese quimioenzimática do Mesilato de Rasagilina (Azilect®), um fármaco utilizado na monoterapia de pacientes com Parkinson no estágio inicial. Um dos objetivos deste trabalho foi realizar a introdução da quiralidade via processos de biocatálise. Foram estudadas duas estratégias: i) biorredução da indanona na presença de uma série de leveduras e ii) resolução cinética do rac-indanol utilizando lipases, em solvente orgânico. Na estratégia (i) realizamos uma triagem com seis leveduras. Em todos os testes realizados o (S)-indanol foi obtido com baixas conversões (9,4-13,2%) e excessos enantioméricos de até 97,6%. Devido aos baixos valores de conversão, decidimos aplicar a estratégia (ii). Após uma triagem com nove lipases comerciais foi possível verificar que a Amano lipase AK a partir da Pseudomonas fluorescens e a Lipase a partir da Thermomyces lanuginosus imobilizada em immobead-150 foram as mais eficientes na resolução cinética do rac-acetato de indanila, em meio aquoso, com razão enantiomérica de 111,0 e 167,0, respectivamente. Com isso, tais lipases foram selecionadas para a resolução cinética do rac-indanol em meio orgânico. Os melhores resultados de seletividade e atividade enzimática foram obtidos utilizando hexano como solvente orgânico, tempo reacional de 15 minutos e temperatura de 30ºC para a Amano lipase AK (enzima livre) e 35ºC para a Thermomyces lanuginosus, com razão enantiomérica>200 para ambos os casos. Foram realizadas imobilizações da Amano AK (enzima livre) em vários suportes e os melhores resultados de seletividade e atividade foram obtidos em hexano como solvente orgânico, tempo reacional de 6 horas e temperatura de 30ºC empregando a Amano lipase AK imobilizada em quitosana 2,5% de baixo peso molecular; alginato de sódio 2,5% e a Amano lipase AK imobilizada em quitosana 5,0% de baixo peso molecular. Foi realizado o estudo de reuso das lipases imobilizadas, sendo a Thermomyces lanuginosus imobilizada em immobead-150, a mais eficiente comparada às demais, uma vez que proporcionou excelentes resultados em maiores ciclos reacionais. Posteriormente, empregando uma reação de Mitsunobu, o (S)-indanol foi convertido no (R)-azidoindano com rendimento de 70%. Em seguida, o (R)-azidoindano foi submetido a uma reação de Staudinger, produzindo a (R)-indanamina com 60% de rendimento.

Submitted by Fernanda Rodrigues de Lima (fernanda.rlima@ufpe.br) on 2018-08-15T22:41:10Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Jeiely Gomes Ferreira.pdf: 10068552 bytes, checksum: 24d204d1fa5cba1ebf810d8954a56d54 (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-08-21T20:16:23Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Jeiely Gomes Ferreira.pdf: 10068552 bytes, checksum: 24d204d1fa5cba1ebf810d8954a56d54 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-21T20:16:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Jeiely Gomes Ferreira.pdf: 10068552 bytes, checksum: 24d204d1fa5cba1ebf810d8954a56d54 (MD5) Previous issue date: 2016-07-29 / CNPq / FACEPE / Dióis propargílicos são intermediários alquinílicos com grande potencial sintético. Embora a utilização destes compostos visando a síntese de produtos naturais bioativos seja conhecida, até ao início deste trabalho, nenhum estudo envolvendo a resolução cinética enzimática (RCE) desta classe de compostos tinha sido relatada na literatura. Com isso, o objetivo principal deste trabalho foi a obtenção de dióis propargílicos em sua forma enantiomericamente enriquecida, a partir de um processo de RCE usando a lipase Candida antarctica como biocatalisador. Os compostos quirais oriundos destas biotransformações seriam então empregados como intermediários sintéticos visando a preparação de moléculas quirais de interesse biológico. Um dos compostos sintetizados, o composto (R,S)-non-2-ino-1,4-diol 20h, foi utilizado na síntese do 4-hidroxi-2-nonenal (4-HNE) 19, um composto detoxicante de ocorrência natural, através do estudo da oxidação regiosseletiva de sistemas alílicos. Além disso, os dióis (R,S)-pent-2-ino-1,4-diol 20a, (R,S)-hept-2-ino-1,4-diol 20c, (R,S)-hex-2-ino-1,4-diol 20g (um produto natural) e 20h foram submetidos a ensaios de atividade citotóxica, mostrando atividades antiproliferativas interessantes. / Propargyl diols are alkynylic intermediates with great synthetic potential. Despite their use aiming at the synthesis of bioactive natural products be known, until the beginning of this thesis, no enzymatic kinetic resolution studies of propargylic diols had been reported yet. Thus, the main objective of this work was the obtaining propargylic diols in its enantiomerically enriched form, from an enzymatic kinetic resolution (EKR) process using Candida antarctica lipase as biocatalyst. Chiral compounds from these biotransformations would then be employed as synthetic intermediates for the preparation of chiral molecules of biological interest. One of the diols synthesized, the compound (R,S)-non-2-yn-1,4-diol (diol 20h) was used in the synthesis of 4-hydroxy-2-nonenal (4-HNE) (diol 19), a detoxicant naturally occurring compound, through the study of regioselective oxidation of allylic systems. Furthermore, when diols (R,S)-pent-2-yn-1,4-diol (diol 20a), (R,S)-hept-2-yn-1,4-diol (diol 20c), (R,S)-hex-2-yn-1,4-diol (diol 20g) (a natural product) and (R,S)-non-2-yn-1,4-diol (diol 20h) were subjected to cytotoxic tests, interesting antiproliferative activities were observed.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-06-02Bitstream added on 2014-06-13T19:29:44Z : No. of bitstreams: 1 kamimura_gkf_me_arafcf.pdf: 713918 bytes, checksum: 90d6ccb478cdaac799bbb870832f99ec (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Os frutos e vegetais apresentam-se fisiologicamente ativos após a colheita, dessa forma as perdas pós-colheita ocorrem pela influência de diferentes fatores onde se destacam a respiração, a temperatura, a umidade, a concentração de oxigênio e gás carbônico, a produção de etileno e a ação de enzimas endógenas associadas com processos de deterioração. As raízes de yacon têm sido cada vez mais consumidas devido à revelação de qualidades medicinais. A manutenção de sua qualidade in natura é um sério problema nos processos pós-colheita devido a inúmeras reações metabólicas. A peroxidase (POD, E.C.1.11.1.7) é largamente encontrada nos vegetais apresentando importante papel fisiológico/bioquímico embora uma precisa função não tenha ainda sido estabelecida. Sua importância para ciência dos alimentos evidencia-se pelas relações com alterações indesejáveis na qualidade e resistência dos vegetais, tornando interessante sua supressão parcial ou total no pós-colheita. Os objetivos desse trabalho foram isolar, purificar e caracterizar a peroxidase de raízes de yacon. Condições de extração para a POD de yacon foram estabelecidas e a enzima foi isolada por precipitação com sulfato de amônio, eluição em Sephadex G-25 e DEAE-celulose. Somente um pico de atividade foi eluído no processo de purificação com um fator de purificação de 222,33. O peso molecular determinado foi 34.8 kDa com valores de pH e temperatura ótima de 5,5 e 35°C, respectivamente. As constantes Km e Vmax foram de 14,227 mM e 17409 UA/mL, para s-dianisidina, e de 14,434 mM e 14830 UA/mL, para H2O2. Foram testados os efeitos inibidores de sais, quelantes, compostos sulfidrila, ácidos fenólicos e outros. Estudos de inativação térmica da POD foram realizados, nos quais se verificou o efeito protetor da sacarose na inativação enzimática e o efeito promotor de inativação pela... / The fruits and vegetables still continue physiologically active after the crop, in that way the postharvest losses occurs by the influence of different factors, like the respiration, temperature, humidity, concentration of oxygen and carbonic gas, ethylene production and the action of endogenous enzymes associated with deterioration processes. Yacon (Smallanthus sonchifolius) roots has been more and more consumed by the revelation of prebiotic and medicinal properties. The maintenance of its quality in the postharvest is a serious problem due to several metabolic reactions. Peroxidase (POD, E.C.1.11.1.7) is widely found in plants, having physiological/biochemical importance, although a precise function has not still been established. The POD importance for food science is due to its relationships with alteration of the quality and resistance of the vegetables to the postharvest factors. Its total or partial suppression by thermal inactivation or inhibitor compounds may be interesting for postharvest interests. The objectives of this work were to isolate, purify and characterize the POD from yacon roots. Extraction conditions for yacon POD were determined and the enzyme was isolated by precipitation with ammonium sulfate, elution on Sephadex G-25 and DEAE-cellulose. Only one peak of enzyme activity was eluted on the purification process with a 222.33 fold purification factor. The determined molecular weight was 34.8 kDa. The optimum pH and temperature values were pH 5.5 and 35°C, respectively. Km and Vmax for ï-dianisidine was 14.227 mM and 17409 UA/mL, and 14.434 mM and 14830 UA/mL for H2O2, respectively. The effects of metals, chelating agents, sulphidryl, phenolic acids and other compounds as POD inhibitors were evaluated... (Complete abstract, click electronic address below).

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6489.pdf: 6160107 bytes, checksum: 81c1fddd8e696b53fe5fd98c9174ba24 (MD5) Previous issue date: 2014-08-29 / Financiadora de Estudos e Projetos / The depletion of fossil fuels, the growing energy demand and the great need to reduce carbon emissions gradually increased the demand for new sources of renewable and clean energy. Bioethanol is obtained from the fermentation of lignocellulosic biomass, for example sugar cane, and can be considered a viable alternative. For this biomass can be used it is necessary to degrade the constituent molecules of the cell wall to fermentable sugars through the enzymes called cellulases. Among them there are three classes with different functions: the cellobiohydrolases, endoglucanases and β-glucosidases. In order to contribute to the viability and deployment of ethanol production technologies, purification of two β- glucosidases of the fungus Trichoderma harzianum was performed, named in this work as ThBgl1 e ThBgl2, as well as their biophysical and biochemical characterization. Clones in study were obtained by a cloning platform, expression and purification of recombinant proteins in high performance and expressed in bacteria Escherichia coli. Through the functional characterization of proteins under study it was found that they had the optimum pH in the range of 5.5 and optimum temperature around 40ºC. Results of enzyme kinetics showed that ThBgl1 has higher preference (specificity) by cellobiose, while in ThBgl2 cellobiose is a substrate having low specificity. In ThBgl2 specificity is higher by fucosideos. Furthermore, it was observed the occurrence of transglycosylation catalyzed by β-glucosidases in study and the action of some inhibitors on its enzymatic activity. The three-dimensional analysis of these proteins revealed the presence of the barrel tim typical of family 1 of glycoside hydrolases. / O esgotamento das fontes de combustíveis fósseis, a crescente demanda energética e a grande necessidade de redução da emissão de carbono fizeram com que aumentasse gradativamente a procura por novas fontes de energia renováveis e limpas. O bioetanol obtido da fermentação de biomassas lignocelulósicas, como o bagaço de cana-de-açúcar, pode ser considerado uma alternativa viável. Para que essa biomassa possa ser utilizada, faz-se necessário a degradação das moléculas constituintes da parede celular a açúcares fermentáveis por meio das enzimas chamadas celulases. Dentre elas existem três classes com diferentes funções: as celobiohidrolases, as endoglucanases e as β-glicosidades. Com o objetivo de contribuir para a viabilização e implantação de tecnologias de produção de etanol, foi realizada a purificação de duas β-glicosidases do fungo Trichoderma harzianum, denominadas nesse trabalho como ThBgl1 e ThBgl2, bem como sua caracterização bioquímica e biofísica. Os clones em estudo foram obtidos por meio de uma plataforma de clonagem, expressão e purificação de proteínas recombinantes em alto desempenho e expressos na bactéria Escherichia coli. Através da caracterização funcional das proteínas em estudo, verificou-se que elas apresentaram o pH ótimo na faixa de 5,5 e temperatura ótima em torno de 40ºC. Os resultados de cinética enzimática mostraram que ThBgl1 tem maior preferência (especificidade) por celobiose, enquanto na ThBgl2 a celobiose é um substrato com baixa especificidade. Na ThBgl2 a especificidade é maior por fucosídeos. Além disso, constatou-se a ocorrência de transglicosilação catalisada pelas β-glicosidases em estudo e a ação de alguns inibidores em sua atividade enzimática. A análise tridimensional dessas proteínas revelou a presença de um barril tim típico das hidrolases de glicosídeos da família 1.

Extradiol dioxigenases são enzimas que catalisam a clivagem oxidativa de ligações C-C entre grupos hidroxila fenólicos adjacentes utilizando catecóis como substratos. Esta classe de enzimas é bem caracterizada em bactérias, onde catalisam a degradação de compostos aromáticos. Na maioria das plantas Caryophyllales, como a beterraba, primavera e a maravilha, L-3,4-diidroxifenilalanina (L-DOPA) extradiol dioxigenases (DODAs) catalisam a clivagem oxidativa de L-DOPA na posição 4,5 gerando o ácido betalâmico, aldeído precursor das betalaínas, uma classe de pigmentos naturais que substitui as antocianinas na pigmentação dessas espécies. Alguns fungos basidiomicetos também produzem betalaínas, como o agário-das-moscas (Amanita muscaria). Nesse organismo, DODA é capaz de catalisar uma clivagem adicional na posição 2,3 da L-DOPA, formando muscaflavina, um isômero do ácido betalâmico que dá origem a uma outra classe de pigmentos naturais: as higroaurinas. Desde a caracterização do gene dodA, o qual codifica para a DODA de A. muscaria (AMAMU), não existem relatos na literatura que explorem a promiscuidade catalítica desta enzima, sua relação com outras linhagens de DODAs e a síntese quimioenzimática de betalaínas a partir desta enzima. Dessa forma, buscamos contextualizar as relações filogenéticas e funcionais entre AMAMU e diferentes linhagens de DODAs, bem como estabelecer um método que viabilize a clonagem, expressão heteróloga e caracterização funcional destaenzima. As análises filogenéticas revelaram que AMAMU possui uma evolução convergente com DODAs de plantas e bactérias e que, apesar de AMAMU ser funcionalmente homóloga à DODA da bactéria Escherichia coli, esta última apresenta homologia com DODAs de plantas. Logo, não há uma relação direta entre a sequência primária de DODAs e sua função. Nós também demonstramos que não há uma relação entre a expressão de transcritos de BvDODA1, e de seu parálogo BvDODA2, e a diferença de pigmentação entre variedades de beterrabas amarelas e vermelhas. A clonagem da sequência codificadora (CDS) publicada para o gene dodA de A. muscaria resultou na retenção do primeiro íntron, o que impedia a sua expressão. Então, uma nova CDS de 558 nucleotídeos foi proposta para este gene, a qual inclui um códon de início da tradução que se mantém na fase de leitura e codifica para uma proteína de 185 resíduos, 43 a menos que AMAMU. A expressão desta CDS resultou na proteína recombinante AmDODA, capaz de catalisar a síntese de ácido betalâmico e muscaflavina a partir de L-DOPA e D-DOPA. AmDODA possui um tamanho aproximado de 22 kDa, com um pH ótimo de atividade de 8,5 e uma constante de Michaelis (KM) de 3,7 ± 0,9 mmol L-1 e de velocidade máxima (Vmax) de 3,3 ± 0,4 µ mol min-1 mg-1. Sua utilização foi demonstrada na síntese quimioenzimática de betalaínas-modelo com potencial aplicação como sondas para microscopia confocal de fluorescência de dois fótons. Neste contexto, esta Tese explora os aspectos moleculares, bioquímicos e biológicos da DODA do fungo A. muscaria e traz importantes contribuições acerca da pigmentação por betalaínas na natureza. / Extradiol dioxigenases are enzymes that catalyze the oxidative cleavage of C-C bonds between adjacent phenolic hydroxyl groups using catechols as substrates. This class of enzymes is well characterized in bacteria, where they catalyze the degradation of aromatic compounds. In most plants of the Order Caryophyllales, such as beet, paperflower and four o\'clock flower, L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) extradiol dioxygenases (DODAs) catalyze the oxidative 4,5-cleavage of L-DOPA generating the betalamic acid, an aldehyde precursor of the betalains, a class of natural pigments that replaces anthocyanins in the pigmentation of these species. Some basidiomycete fungi also produce betalains, such as the fly agaric (Amanita muscaria). In this organism, DODA is able to catalyze an additional 2,3-cleavage of L-DOPA, yielding muscaflavine, an isomer of betalamic acid that gives rise to another class of natural pigments: the hygroaurins. Since the characterization of the dodA gene, which encodes the A. muscaria DODA (AMAMU), there are no reports in the literature that explore the catalytic promiscuity of this enzyme, its relation to other DODAs and the chemoenzymatic synthesis of betalains from this enzyme. Thus, we seek to contextualize the phylogenetic and functional relationships between AMAMU and different DODA lineages, as well as to establish a method that enable the cloning, heterologous expression and functional characterization of this enzyme. Phylogenetic analysis revealed that AMAMU has a convergent evolutionwith plant and bacterial DODAs and that although AMAMU is functionally homologous to the DODA of the Escherichia coli bacteria, this latter is homologous to the plant DODAs. Therefore, there is no direct relationship between the primary sequence of DODAs and their function. We have also shown that there is no relationship between the expression of BvDODA1 transcripts, and its BvDODA2 paralogue, and the pigment difference between yellow and red beet varieties. Cloning of the published coding sequence (CDS) for the dodA gene of A. muscaria resulted in the retention of the first intron, which prevented its expression. Then, a new CDS of 558 nucleotides was proposed for this gene, which includes a translation start codon that remains in the open reading frame and encodes for a protein 185 residues long, 43 less than AMAMU. Expression of this CDS resulted in the recombinant AmDODA protein, able to catalyze the synthesis of betalamic acid and muscaflavine from L-DOPA and D-DOPA. AmDODA has an approximate size of 22 kDa, with an optimum activity pH of 8.5 and a Michaelis constant (KM) of 3.7 ± 0.9 mmol L-1 and a maximum velocity (Vmax) of 3.3 ± 0.4 µmol min-1 mg-1. Its use was demonstrated in the chemoenzymatic synthesis of betalains-model with potential application as probes for confocal microscopy of two-photon fluorescence. In this context, this thesis explores the molecular, biochemical and biological aspects of the DODA of the fungus A. muscaria and brings important contributions about the pigmentation by betalains in nature.

Fumarato hidratases ou fumarases (FH) catalisam a reação estereoespecífica reversível de hidratação do fumarato em L-malato. Essas enzimas se apresentam em todas as classes de organismos, desde procariotos a eucariotos, e podem ser encontradas nas formas mitocondrial e citosólica. A enzima tem papel importante na produção de energia pois participa do ciclo do ácido cítrico, na resposta ao dano do DNA e como supressor tumoral. A fumarase humana (HsFH), que pertence à classe II, é codificada pelo gene 1q42.1, possui 467 aminoácidos em cada monômero com peso molecular de 50,2 kDa cada. Estudos associaram mutações no gene da FH com diversas doenças humanas como acidúria fumárica, leiomiomatoses de útero e pele (MCUL), que quando associadas com um agressivo carcinoma múltiplo de células é conhecido como leiomiomatose hereditária e câncer renal (HLRCC). Apesar da grande importância da fumarase humana no metabolismo energético, ainda há pouca informação em relação ao mecanismo catalítico adotado pela enzima e o efeito estrutural e cinético causado pelas mutações envolvidas com essas doenças. Diante disso, nosso trabalho utilizou uma abordagem híbrida que envolve a caracterização biofísica, bioquímica e estrutural da enzima HsFH, e seus mutantes: N107THsFH, H180RHsFH, Q185RHsFH, K230RHsFH, G282VHsFH, E362QHsFH, S365GHsFH e N373DHsFH, identificados em pacientes. Estudos cinéticos foram realizados em sete diferentes pHs e, pela primeira vez para fumarases, o ensaio foi realizado com os dois substratos presentes na mesma mistura reacional, confirmando a contribuição da reação reversa para a velocidade global da enzima. De acordo com os estudos de termoflúor a proteína é estabilizada em pHs alcalinos e através da ligação de compostos no sítio ativo. A estrutura da enzima HsFH nativa foi resolvida a 1,8 Å e identificou a presença de moléculas de HEPES complexadas na região C-terminal da enzima. Os estudos cinéticos demonstraram um aumento da eficiência catalítica na presença do HEPES, sugerindo um possível papel alostérico de seu sítio de ligação para a atividade catalítica. Foram determinadas as estruturas para os mutantes N107THsFH, H180RHsFH, Q185RHsFH, K230RHsFH, E362QHsFH, S365GHsFH e N373DHsFH. As mutações Q185R, E362Q, S365G e N373D foram identificadas no sítio ativo afetando diretamente a capacidade da proteína em ligar os substratos, enquanto que a mutação H180R foi localizada no sítio B, que conduz os substratos e produtos para dentro e fora do sítio ativo. Já a mutação K230R está localizada no domínio central, mas os resultados de termoflúor demonstram um efeito direto na capacidade da enzima em acomodar o substrato. A mutação N107T, localizada longe do sítio ativo foi a única que permaneceu ativa e teve seus parâmetros cinéticos residuais determinados. O presente trabalho contribui para o entendimento das bases estruturais que correlacionam mutações na HsFH, deficiência enzimática e patologia. / Fumarate hydratases or fumarases (FH) catalyze the reversible stereospecific hydration of fumarate to L-malate. They are present in all classes of organisms, from prokaryotes to eukaryotes, and can be found in the mitochondrial and cytosolic forms. The enzyme has an important role in energy production as part of the well-known Citric Acid Cycle, in DNA damage response and as tumor suppressor. Human fumarase (HsFH) belongs to class II and is encoded by 1q42.1 gene. HsFH is tetrameric and has 467 amino acids per monomer, with predicted molecular weight of 50.2 kDa. Several studies associated FH gene mutations with some human diseases such as fumaric aciduria, multiple cutaneous and uterine leiomyomatosis (MCUL), which when associated with an aggressive form of multiple cell carcinoma is known as hereditary leiomyomatosis and renal cancer (HLRCC) syndrome. Although the major role of HsFH in energetic metabolism, there are still little structural and kinetic information about the mutants involved in these diseases. Thus, this study aims, through a hybrid approach, composed by biophysics, biochemical and structural characterization of mutants N107THsFH, H180RHsFH, Q185RHsFH, K230RHsFH, G282VHsFH, E362QHsFH, S365GHsFH and N373DHsFH identified from patients. Steady-state kinetics studies were performed in seven different pHs and, for the first time, the contribution of both substrates was analyzed simultaneously in a single kinetic assay and allowed to quantify the contribution of the reverse reaction for kinetics. According to thermofluor studies, structural stability can be achieved at alkaline pHs and suggests that ligand binding can modulate the protein stability. HsFH crystal structure was solved at 1.8 Å resolution and identified HEPES molecules complexed with the enzyme C-terminal region. Kinetics studies with HEPES showed an increase of the catalytic efficiency and suggests that HEPES binding site might have an allosteric role. Crystal structures for the mutants N107THsFH, H180RHsFH, Q185RHsFH, K230RHsFH, E362QHsFH, S365GHsFH and N373DHsFH were determined. The mutations Q185R, E362Q, S365G and N373D were identified in the active site and affect the substrate binding capacity directly, while mutation H180R was localized in the B site, which conducts the substrates and products in and out the active site. The mutation K230R is localized in the central domain, but thermofluor results demonstrate a direct effect on the ability of the enzyme to accommodate the substrate. The N107T mutation located far from the active site was the only one that remained active and had its residual kinetic parameters determined. The present work contributes to the understanding of the structural bases that correlate mutations in HsFH, enzymatic deficiency and pathology.

A enzima glicossomal gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) de Tripanosoma cruzi e os mutantes D210L e D210L-G213D foram expressos em E. coli, purificados e submetidos a ensaios de cinética enzimática e de cristalização. A enzima GAPDH tipo selvagem e o mutante D210L-G213D cristalizaram-se no grupo espacial P21 e os cristais apresentaram padrões de difração de raios-X de boa qualidade. A estrutura cristalográfica da enzima tipo selvagem foi determinada a 2.5 e 2.15 A de resolução, a partir de coletas de dados realizadas a 277 e 100 K respectivamente. Os fatores R cristalográficos finais dos refinamentos foram de 16.0% para a estrutura a 277 K e 18.8% para a estrutura a 100 K. A estrutura do mutante GAPDH D210L-G213D foi determinada a 2.15 A de resolução e refinada até um fator R cristalográfico de 18.9%. A comparação entre as estruturas da enzima tipo selvagem determinadas nas duas temperaturas levou a resultados interessantes no que diz respeito ao empacotamento cristalino. O resfriamento dos cristais provocou uma redução no volume da cela unitária de 10.5%, tendo a maior variação ocorrido no parâmetro de rede a (14.5%). A sobreposição das celas unitárias mostrou uma rotação do conteúdo da unidade assimétrica de cerca de 5 graus em torno de um eixo aproximadamente paralelo a b. Por outro lado, a análise das estruturas da enzima tipo selvagem e mutante, juntamente com os parâmetros cinéticos, permitiram a discussão a respeito de alguns detalhes do mecanismo catalítico da enzima, principalmente no que se refere ao papel do resíduo Arg249. Tal resíduo, que apresenta grande mobilidade conformacional de sua cadeia lateral, parece estar envolvido na etapa de reorientação de um dos intermediários durante o processo catalítico. / The glycosomal glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) from Typanosoma cruzi and its mutants D210L and D210L-G213D were expressed in E. coli and purified, followed by kinetic and crystallization assays. Both wild type enzyme and D210L-G213D mutant were crystallized in P21 space group and the crystals presented good X-ray diffraction patterns. The three-dimensional structure of the wild type enzyme was determined at 2.5 and 2.15 A resolution from data collected at 277 and 100 K respectively. The structures were refined to a crystallographic R-factor of 16.0% for data collected at 277 K and 18.8% for those collected at 100 K. Also, the structure of the D210L-G213D mutant was solved at 2.15 A resolution and refined to a crystallographic R-factor of 18.9% with good geometry indicators. Comparison between the wild type enzyme structures solved at both temperatures led to interesting results concerning the crystal packing. Flash-cooled crystals presented a 10.5% shrink in the unit cell volume being the major reduction observed in the parameter a (14.5%). Superposition of the unit cells showed a global rotation of the asyrnmetric unit content of about 5 degrees around an axis approximately parallel to b. On the other hand, the analysis of the wild type and mutant enzyme structures, together with the kinetic parameters, allowed a discussion about some catalytic mecanism details, mainly the role of the Arg249 residue. The results showed that this residue might be involved in the reorientation of one of the intermediates during the catalytic process.

Os osteoblastos são responsáveis pelo início do processo de biomineralização óssea mediada pela liberação de vesículas da matriz (MVs). As MVs surgem por brotamento das superfícies laterais dos osteoblastos e são secretadas para a matriz. A membrana das MVs possuem níveis elevados de Fosfatase Alcalina (TNAP), entre outra enzimas/proteínas, bem como de Chol, em comparação com a membrana plasmática. O objetivo deste estudo foi a construção de proteolipossomos constituídos por Dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) ou Dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), com Colesterol (Chol) em diferentes proporções para a caracterização cinética da TNAP, utilizando os substratos ATP, PPi e ADP, a fim de se obter um sistema que mimetize as MVs. O aumento da concentração de Chol dificultou a incorporação da TNAP aos sistemas constituídos com DPPC, e facilitou a sua incorporação aos constituídos por DOPC. A presença do Chol em todos os sistemas miméticos preparados afetou os parâmetros cinéticos de hidrólise da TNAP para todos os substratos estudados. Entretanto, independentemente da presença do Chol, a hidrólise do PPi apresentou sempre uma maior eficiência (maior kcat/K0.5), sugerindo que este substrato provavelmente possa ser hidrolisado preferencialmente. O tratamento com 2 mM de ciclodextrina (bmCD), resultou na remoção de apenas 70% do Chol de proteolipossomos constituídos por DPPC:Chol 36% mol. Estudos de calorimetria diferencial (DSC) revelaram que a bmCD fica ligada ao sistemas vesiculares causando interferência para os demais ensaios. Quando 36% mol de colestenona (Achol), um análogo de Chol, foi empregado na construção dos proteolipossomos de DPPC, foram encontrados comportamentos cinéticos distintos para a TNAP. O ATP foi hidrolisado com uma Vmáx menor que a os sistemas constituídos por DPPC:Chol 36% e maior do que para sistemas de DOPC:Chol 36% mol. Os valores de K0.5 foram menores para DPPC:Achol 36 % mol em comparação aos sistemas análogos. Com relação a hidrolise do PPi, os parâmetros cinéticos foram similares, em relação aos sistemas estudados contendo DPPC:Chol ou DOPC:Chol. Por fim, foi avaliada a capacidade de propagação de nódulos de mineralização pelos sistemas vesiculares contendo DPPC, DPPC:Chol e DPPC:Achol (com e sem TNAP incorporada), utilizando o ATP como substrato. A mineralização foi cerda de 16 vezes mais eficiente na presença de protelipossomos que continham tanto Chol ou colestenona, do que para o sistema somente constituído por DPPC (cerca de 4 vezes), quando comparados com os respectivos sistemas de lipossomos (na ausência de enzima). Diante destas diferenças apresentadas, tanto no comportamento cinético, quanto na capacidade de mineralização, pode-se suger que o microambiente lipídico tem um importante papel das MVs. Uma explicação que pode ser sugerida é que fatores termodinâmicos como: a diminuição da entalpia de transição; perda de pré-transição; presença de cargas superficiais; presença de diferentes substratos; bem como, orientações das ligações de hidrogênio com a molécula de água na superfície dos proteolipossomos, podem acarretar em modificações conformacionais na TNAP. A relevância dos resultados apresentados pode contribuir no entendimento da função dos lipídios e de suas interações com as proteínas presentes na MVs no processo de biomineralização. / Osteoblasts are responsible for initiating the bone biomineralization process mediated by the release of matrix vesicles (MVs). The MVs arise by budding from the membrane of the osteoblasts and are secreted into the matrix. The MVs membrane has high levels of tissue non-specific alkaline phosphatase (TNAP), among other enzymes/proteins, as well as cholesterol, compared with the plasma membrane. The objective of this study was to build proteoliposomes constituted by Dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) or dioleoylphosphatidylcholine (DOPC), with cholesterol (Chol) in different molar ratios for the kinetic characterization of TNAP, using the substrates ATP, ADP and PPi, in order to obtain systems that mimic the MVs. The increase in the cholesterol concentration hampered the incorporation of TNAP into the DPPC systems, but favored its incorporation into the DOPC liposomes. The presence of cholesterol in all prepared mimetic systems affected the kinetic parameters of hydrolysis for all substrates studied. Regardless of the presence of cholesterol, PPi hydrolysis always showed greater catalytic efficiency (kcat/K0.5), suggesting a preferential hydrolysis of this substrate. Treatment with 2 mM cyclodextrin (BMCD) resulted in removal of 70% of the cholesterol from the proteoliposome constituted of DPPC:Cholesterol 36% (molar ratio). Differential scanning calorimetry (DSC) studies showed that BMCD was bound to the vesicular systems interfering with the other assays. When 36% of cholestenone (Achol), an analogue of cholesterol, was employed in the construction of DPPC proteoliposomes, a different kinetic behavior was observed for TNAP. The Vmax for ATP hydrolysis was lower compared with the systems constituted of DPPC:Chol 36% and higher than that obtained for the DOPC:Chol 36% system. The values of K0.5 were lower for DPPC:Achol 36% compared to the similar systems. With respect to the hydrolysis of PPi, the kinetic parameters were similar for the systems constituted of DPPC:Chol and DOPC:Chol. Finally, we evaluated the ability of the vesicular systems containing DPPC, DPPC:Chol and DPPC:Achol (with and without TNAP incorporated) to propagate mineralization nodules, using ATP as substrate. The mineralization was about 16 times more efficient in the presence of proteoliposomes containing Chol or Achol than for the system constituted of DPPC only (about 4 times more efficient) compared with the corresponding liposome (in the absence of enzyme). Given the differences observed for both the kinetic behavior and the mineralization ability of the different systems, we suggest that the lipid microenvironment plays an important role in MVs function. A possible explanation for these differences is that thermodynamic factors such as the decrease in the enthalpy of transition and the loss of pre-transition, as well as the presence of surface charges, the presence of different substrates, and the orientation of hydrogen bonds with the water molecule on the surface of the proteoliposomes, may cause conformational changes in TNAP molecule. These relevant results can contribute for the understanding of the role of lipids and their interactions with proteins present in MVs in the biomineralization process.

O parasita Schistosoma mansoni não possui a via de síntese de bases púricas e depende integralmente da via de salvação de purinas para o seu requerimento de purinas. Uma das enzimas participantes desta via é a Purina Nucleosídeo Fosforilase (PNP) (E.C. 2.4.2.1). A PNP catalisa a fosforólise reversível de nucleosídeos de purina para gerar a base correspondente e ribose-1-fosfato. No Projeto Genoma de Schistosoma mansoni, o gene para esta enzima foi identificado.O cDNA para a PNP de S. mansoni (SmPNP), possui 1055pb e codifica para uma proteína de 287 aminoácidos, que possui 49% de identidade quando comparada a PNP de eritrócitos humana ou de Baco bovino. O gene foi clonado no vetor de expressão pMAL C2G, e expresso na forma de uma proteína de fusão, com MBP (80mg/L). Após a purificação da proteína de fusão, a clivagem proteolítica das duas proteínas foi realizada utilizando-se o Factor Xa. A SmPNP foi então purificada utilizando uma coluna de troca catiônica. Foram determinadas as constantes catalíticas para a fosforólise de inosina pela SmPNP, as quais são 3?M para o KM e 222 s-1para o kcat. O valor para o KM é O menor já descrito para uma PNP de baixa massa molecular. Foram obtidos cristais da SmPNP utilizando 18-24 % de PEG 1500, 20% de glicerol em 32mM de tampão acetato de sódio pH 4,9-5,O. Quando utilizado o aditivo NDSB195 na cristalização da SmPNP a solução de cristalização foi 28-30% de PEG 1500, 20% de glicerol em 32mM de tampão acetato de sódio pH 4,9-5,O. Cinco conjuntos de dados de difração de raios X foram obtidos tanto na presença como na ausência de ligantes. A resolução deste conjuntos de dados variou de 2,75? a 1,75 ?. Todas estas estruturas foram resolvidas pelo método da substituição molecular, sendo que na primeira estrutura resolvida (a 2,75?) foi utilizado a estrutura da PNP bovina como modelo de busca, e na resolução das estruturas subsequentes foi utilizado a estrutura da SmPNP como modelo de busca. A estrutura da SmPNP a 1,75? de resolução foi obtida a partir de um cristal crescido na presença de NDSB 195, e após sua resolução foi encontrado este composto ligado em todos os sítios ativos da SmPNP via a sítio de ligação do fosfato. Foram também obtidas as estruturas da SmPNP na forma apo a 1,9? de resolução e em complexo com fosfato a 2,0? de resolução. Todas as estruturas foram utilizadas na comparação com outras PNPs de baixa massa molecular. Utilizando a estrutura da SmPNP a 1,75? de resolução, foi realizada uma busca por compostos (Virtual Screening) que ligassem a SmPNP. Nesta busca foi utilizando o programa GOLD, utilizando uma base de dados de cerca de 36000 compostos com peso molecular inferior a 280 Da. Vinte e dois compostos foram selecionados com base no escore de docking e pelas interações (pontes de hidrogênio) com os resíduos chave do sítio ativo. Utilizando PNP bovina e a mesma abordagem de docking foram selecionados 19 compostos. Estes compostos foram ensaiados contra a SmPNP e 12 compostos se mostraram capazes de inibir a SmPNP. Um complexo entre a SmPNP e o composto AT2169 (oriundo do VS) foi obtido e refinado. Esta abordagem foi validada utilizando ligantes conhecidos das PNPs. / The parasite Schistosoma mansoni, unlike its mammalian hosts, lacks the \"de novo\" pathway for purine biosynthesis and depends on the salvage pathways for its purine requirements. One component of this pathway is Purine Nucleoside Phosphorylase (PNP) (E.C. 2.4.2.1). PNP catalyzes the reversible phosphorolysis of purine nucleosides to generate the corresponding purine base and ribose 1-phosphate. In the Schistosoma mansoni Genome Project the gene for this enzyme was isolated. The SmPNP cDNA was sequenced, corresponding to 1055 bases that code for a 287 amino acid protein with 49% sequence identity to its human erythrocyte homologue. The SmPNP gene was cloned into the pMAL C2G expression vector and the recombinant fusion protein was produced and purified using an amylose affinity column (approx. 80mg/mL). The fusion protein is composed of a Maltose Binding Protein adjoined to the SmPNP. After cleavage with Factor Xa, the cleavage product was purified using a cation exchange column. The KM and kcat of SmPNP for inosine phosphorolisis was determined to be 3?M and 222 s-1 respectively. This corresponds to the lowest value for KM yet described for a low molecular mass PNP. SmPNP crystals were obtained by the hanging drop method, using 18-24% PEG 1500, 20% glycerol in the presence of 32mM sodium acetate buffer (pH 4.9-5.0). When NDSB195 was used as an additive in the SmPNP crystallization the solution used was 28-30% PEG 1500, 20% glycerol and 32mM sodium acetate buffer (pH 4.9-5.O).Five datasets were obtained in the presence and absence of ligands, varying in resolution from 2,75 to 1,75?. All structures were solved by the molecular replacement method. The first structure (at 2,75?) was solved using the bovine PNP as the search model and in the remaining structures the search model was the SmPNP structure itself. The 1,75? structure was obtained from a crystal grow in the presence of the additive NDSB195, and after its determination NDSB195 was observed bound to the SmPNP active site via its phosphate binding site. Structures were also obtained for the apo SmPNP at 1,9? and its complex with phosphate at 2,0? resolution. All structures were used in the comparison with other low molecular mass PNPs. The SmPNP structure at 1,75A resolution was used in the search small molecule ligands, which potentially bind to SmPNP via virtual screening. For this purpose the program Gold together with a database of 36000 compounds with MW lower than 280Da was used. As a result 22 compounds were selected using the docking score and the H-bonding interaction with the key residues of the SmPNP active site. Using the bovine PNP and same docking approach 19 compounds were selected. These 41 compounds were assayed against SmPNP enzyme and 12 compounds were active against the SmPNP. One complex between SmPNP and one of these compound (AT2 169) was obtained and refined. This virtual screening approach was validated using known ligands of PNPs including inosine, guanosine, immucilins, etc.