A tolerância materno-fetaI continua a ser um intrigante enigma imunológico. Algumas teorias têm sido propostas sobre o estabelecimento deste estado, tais como a produção de moléculas solúveis como HLA-G (na gestação humana) por células fetais que inibiriam a atividade de células do sistema imune inato. Além da secreção de hormônios; liberação de citocinas e de alguns fatores pelo trofoblasto que induziriam alterações no micro-ambiente placentário favorecendo o sucesso da gestação. A tolerãncia materno-fetal parece ser resultar da interação de eventos específicos ou não da gestação. Neste contexto, a indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO), uma enzima com transcrição induzida pelo INF-y, tem sua atividade relacionada com o estabelecimento de estado de tolerância materno frente a antígenos fetais em mulheres e em camundongas. A IDO catabolisa o triptofano, um aminoácido essencial, do micro-ambiente placentário. Desta forma, células T ativadas no tecido placentário não conseguem proliferar estacionando na fase G1 do ciclo celular, ma forma de regulação da resposta imune materna. O presente trabalho teve por objetivo analisar as concentrações de triptofano e seus produtos de catabolismo no tecido placentário bovino em gestações normais e de fetos donados. Homogenatos de tecidos placentários provenientes de gestações normais (n=29) e de fetos donados (n=5) foram analisados por cromatrografia líquida de alta performance (HPLC). O níveis de triptofano e quinurenina aumentaram com o avanço da idade gestacional; TRIPTOFANO: 479,33µM/L ±53,04ep; 745,87µM/L ±72,71ep; 983,39µM/L ±196,37ep no primeiro, segundo e terceiro trimestre da prenhez respectivamente; QUINURENINA: 15,13µM/L ±2,97ep; 25,26µM/L ±3,72ep; 52,77µM/L ±17,75ep no primeiro, segundo e terceiro trimestre da prenhez respectivamente. A razão quinurenina/triptofano (razão Q/T) não alterou durante a gestação (0.038 ±0.011ep, 0.035 ±0.005ep and 0.056 ±0,020ep; no primeiro, segundo e terceiro trimestre da prenhez respectivamente). Quando esses valores foram comparados à placentas provenientes de fetos clonados apresentaram-se menores, contudo sem diferenças estatísticas significantes. (0,031 ±0.003ep). Os valores de triptofano foram menores na gestação de clones (811,34µM/L ±232,14ep) bem como os encontrados de quinurenina (22,85µM/L ±4,09ep). Não houve diferenças estatisticamente significativas entre o terceiro trimestre gestacional de fetos normais quando comparados à gestação de clones neste contexto. O catabolismo de triptofano parece aumentar com o avanço da idade gestacional devido o aumento da concentração do aminoácido e de seus metabólitos (quinurenina), no entanto a razão Q/T não se alterou, sugerindo um aumento da atividade de IDO na placenta bovina para manutenção dos níveis de triptofano no micro-ambiente placentário. A presença de quinurenina na placenta bovina é um indicador da atividade da IDO neste tecido. / Maternal-fetal tolerance continues to be an intriguing immunological enigma. Some theories have been proposed about these phenomena such as the production of soluble molecules like HLA-G by fetal cells that would block some cells of the innate immune system and the secretion of cytokines, hormones and some factors by trophoblast cells that would induce changes in the placental microenvironment. Maternal tolerance is probably the consequence of a wide panel of mechanisms that may be or not pregnancy-specific. In this context, indoleamine 2, 3 dioxygenase (IDO), an inducible INFy enzyme, is a candidate protein to be involved in placental tolerance, as suggested in some reports on women pregnancy. IDO seems to catabolise the tryptophan, an essential amino acid necessary to cell proliferation. This way, activated T-cells in placental tis sue cannot proliferate due to starvation of tryptophan in milieu and these cells undergo apoptosis. This change may be one of the ways maternal-fetal tolerance occurs. Our aim was to evaluate the levels of tryptophan and its degradation products in normal and cloned bovine pregnancy, observing possible changes in tryptophan catabolism during this period. Homogenates from normal placental tissue from cows with normal (n=29) and cloned pregnancy (n=5) were analyzed by high performance liquid chromatograph. Levels of tryptophan and kinurenine reached their highest levels through of time of pregnancy; TRIPTOPHAN: 479,33µM/L ±53,04ste; 745,87µM/L ±72,71ste; 983,39µM/L ±196,37ste early. middle and late pregnancy respectively; KINURENINE: 15,13µM/L ±2,97ste; 25,26µM/L 3,72ste; 52,77µM/L ±17,75ste early. middle and late pregnancy respectively. The ratios of kynurenine to tryptophan does not increased during pregnancy (0.038 ±0.011ste, 0.035 ±0.005ste and 0.056 ±0,020ste; early, middle and late pregnancy respectively). When these values were compared to cloned pregnancy they showed lower values in these animais, however they were not statiscally significant (0,031 ±0.003ste). Tryptophan values were lower in cloned pregnancy (811,34µM/L ± ±232, 14ste) as well kinurenine (22,85µM/L ±4,09stde). There was no statiscal difference between normal late pregnancy and cloned pregnancy in this mater. The presence of kinurenine in bovine placental tissue is one indicator that IDO could be expressed in bovine placenta and indicate an IDO activity in this site.

A tolerância materno-fetaI continua a ser um intrigante enigma imunológico. Algumas teorias têm sido propostas sobre o estabelecimento deste estado, tais como a produção de moléculas solúveis como HLA-G (na gestação humana) por células fetais que inibiriam a atividade de células do sistema imune inato. Além da secreção de hormônios; liberação de citocinas e de alguns fatores pelo trofoblasto que induziriam alterações no micro-ambiente placentário favorecendo o sucesso da gestação. A tolerãncia materno-fetal parece ser resultar da interação de eventos específicos ou não da gestação. Neste contexto, a indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO), uma enzima com transcrição induzida pelo INF-y, tem sua atividade relacionada com o estabelecimento de estado de tolerância materno frente a antígenos fetais em mulheres e em camundongas. A IDO catabolisa o triptofano, um aminoácido essencial, do micro-ambiente placentário. Desta forma, células T ativadas no tecido placentário não conseguem proliferar estacionando na fase G1 do ciclo celular, ma forma de regulação da resposta imune materna. O presente trabalho teve por objetivo analisar as concentrações de triptofano e seus produtos de catabolismo no tecido placentário bovino em gestações normais e de fetos donados. Homogenatos de tecidos placentários provenientes de gestações normais (n=29) e de fetos donados (n=5) foram analisados por cromatrografia líquida de alta performance (HPLC). O níveis de triptofano e quinurenina aumentaram com o avanço da idade gestacional; TRIPTOFANO: 479,33µM/L ±53,04ep; 745,87µM/L ±72,71ep; 983,39µM/L ±196,37ep no primeiro, segundo e terceiro trimestre da prenhez respectivamente; QUINURENINA: 15,13µM/L ±2,97ep; 25,26µM/L ±3,72ep; 52,77µM/L ±17,75ep no primeiro, segundo e terceiro trimestre da prenhez respectivamente. A razão quinurenina/triptofano (razão Q/T) não alterou durante a gestação (0.038 ±0.011ep, 0.035 ±0.005ep and 0.056 ±0,020ep; no primeiro, segundo e terceiro trimestre da prenhez respectivamente). Quando esses valores foram comparados à placentas provenientes de fetos clonados apresentaram-se menores, contudo sem diferenças estatísticas significantes. (0,031 ±0.003ep). Os valores de triptofano foram menores na gestação de clones (811,34µM/L ±232,14ep) bem como os encontrados de quinurenina (22,85µM/L ±4,09ep). Não houve diferenças estatisticamente significativas entre o terceiro trimestre gestacional de fetos normais quando comparados à gestação de clones neste contexto. O catabolismo de triptofano parece aumentar com o avanço da idade gestacional devido o aumento da concentração do aminoácido e de seus metabólitos (quinurenina), no entanto a razão Q/T não se alterou, sugerindo um aumento da atividade de IDO na placenta bovina para manutenção dos níveis de triptofano no micro-ambiente placentário. A presença de quinurenina na placenta bovina é um indicador da atividade da IDO neste tecido. / Maternal-fetal tolerance continues to be an intriguing immunological enigma. Some theories have been proposed about these phenomena such as the production of soluble molecules like HLA-G by fetal cells that would block some cells of the innate immune system and the secretion of cytokines, hormones and some factors by trophoblast cells that would induce changes in the placental microenvironment. Maternal tolerance is probably the consequence of a wide panel of mechanisms that may be or not pregnancy-specific. In this context, indoleamine 2, 3 dioxygenase (IDO), an inducible INFy enzyme, is a candidate protein to be involved in placental tolerance, as suggested in some reports on women pregnancy. IDO seems to catabolise the tryptophan, an essential amino acid necessary to cell proliferation. This way, activated T-cells in placental tis sue cannot proliferate due to starvation of tryptophan in milieu and these cells undergo apoptosis. This change may be one of the ways maternal-fetal tolerance occurs. Our aim was to evaluate the levels of tryptophan and its degradation products in normal and cloned bovine pregnancy, observing possible changes in tryptophan catabolism during this period. Homogenates from normal placental tissue from cows with normal (n=29) and cloned pregnancy (n=5) were analyzed by high performance liquid chromatograph. Levels of tryptophan and kinurenine reached their highest levels through of time of pregnancy; TRIPTOPHAN: 479,33µM/L ±53,04ste; 745,87µM/L ±72,71ste; 983,39µM/L ±196,37ste early. middle and late pregnancy respectively; KINURENINE: 15,13µM/L ±2,97ste; 25,26µM/L 3,72ste; 52,77µM/L ±17,75ste early. middle and late pregnancy respectively. The ratios of kynurenine to tryptophan does not increased during pregnancy (0.038 ±0.011ste, 0.035 ±0.005ste and 0.056 ±0,020ste; early, middle and late pregnancy respectively). When these values were compared to cloned pregnancy they showed lower values in these animais, however they were not statiscally significant (0,031 ±0.003ste). Tryptophan values were lower in cloned pregnancy (811,34µM/L ± ±232, 14ste) as well kinurenine (22,85µM/L ±4,09stde). There was no statiscal difference between normal late pregnancy and cloned pregnancy in this mater. The presence of kinurenine in bovine placental tissue is one indicator that IDO could be expressed in bovine placenta and indicate an IDO activity in this site.

Submitted by orjuela@ibilce.unesp.br (orjuela@ibilce.unesp.br) on 2016-02-17T12:16:38Z No. of bitstreams: 1 Isolamento de bactérias degradadoras de hidrocarbonetos aromáticos 1-107.pdf: 3940758 bytes, checksum: c39dfe1dada0d918848470d3f0de5b83 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-02-17T13:16:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 orjuela_gl_dr_rcla.pdf: 3940758 bytes, checksum: c39dfe1dada0d918848470d3f0de5b83 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-17T13:16:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 orjuela_gl_dr_rcla.pdf: 3940758 bytes, checksum: c39dfe1dada0d918848470d3f0de5b83 (MD5) Previous issue date: 2016-02-11 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Este documento foi organizado em dois capítulos. O Capítulo I é um artigo de revisão intitulado “Metabolic Pathways for Aromatic Compounds Degradation by Bacteria”, no qual são descritas as fontes naturais e antrópicas dos hidrocarbonetos aromáticos e suas características químicas. Relacionaram-se os fatores ambientais que afetam a degradação aeróbia e anaeróbia desses compostos por bactérias e os principais compostos intermediários produzidos. É descrita passo a passo a sequência de preparação e desaromatização do anel benzênico e os compostos finais dessa degradação. O artigo foi publicado no volume 237 da série Reviews of Environmental Contamination and Toxicology em janeiro de 2016 (Springer http://dx.doi.org/10.1007/978-3-319-23573-8_5). O Capítulo II contém os resultados da pesquisa desenvolvida. O objetivo geral foi isolar cepas bacterianas de amostras de solo e avaliar o potencial degradador de fenol e outros hidrocarbonetos aromáticos. Foram realizadas coletas de amostras de solo de cinco postos de combustíveis, para a seleção das cepas bacterianas e para análises químicas e granulométricas. Alíquotas das amostras de solo foram transferidas para meio de cultura seletivo contendo querosene como única fonte de carbono. Testes morfológicos e bioquímicos indicaram que as cepas isoladas são Gram negativas, móveis, catalase positivas, produtoras de cápsula e de biossurfactantes. O sequenciamento do gene 16S rRNA mostrou 99 a 100% de similaridade com o gênero Pseudomonas sp. Todas as cepas degradaram o fenol em concentração de 120 mg L-1 em menos de 24 horas. Testes da atividade enzimática mostraram que algumas das cepas expressaram a catecol 1,2-dioxigenase que catalisa a orto-clivagem do anel benzênico e outras expressaram a catecol 2,3 dioxigenase da meta-clivagem do anel aromático. Uma cepa não apresentou atividade para nenhuma dessas duas enzimas e uma apresentou atividade de ambas. Todas as cepas foram capazes de crescer em presença de fenantreno, fluoranteno e pireno. / This document is organized in two chapters. The Chapter I is a review paper entitled “Metabolic Pathways for Aromatic Compounds Degradation by Bacteria” in which are described natural and anthropogenic sources of aromatic hydrocarbons and their chemical characteristics. There are listed environmental factors that affect the aerobic and anaerobic degradation by bacteria and the central intermediates yielded. It is described step to step of sequence of preparation and dearomatization of benzene ring and the final metabolites of breakdown. The manuscript was publicated in the volume 237 of Reviews of Environmental Contamination and Toxicology in January of 2016 (Springer http://dx.doi.org/10.1007/978-3- 319-23573-8_5). Chapter II has the results of developed research. The general objective was to isolate bacterial strains from samples of soil and to evaluate the potential of them for breakdown hydrocarbons. Soil samples from five gas stations were collected to isolate the bacterial strains and chemical and granulometric analysis was made. Aliquots of the soil samples were cultured with selective media with kerosene as only carbon and energy sources. Morphological and biochemical tests showed that bacterial strains were Gram negatives, motile, positive catalase, capsule-producers and biosurfactant producers. The sequencing of 16S rRNA gene showed 99 to 100% similarity with Pseudomonas sp genera. All bacterial strains were able to degrade phenol 120 mg L-1 in less than 24 hours. Tests of enzymatic activity showed that some bacteria expressed the catecol 1,2-dioxygenase that catalyze ortoclivage of benzene ring, others showed activity for the catecol 2,3-dioxygenase that catalyze the meta-cleavage of the ring. One strain did not show activity for any of these enzymes and one strain had activity for both. All strains were able to growth with fenantrene, fluoranthene and pyrene. / CNPq: 140704/2012-4

Extradiol dioxigenases são enzimas que catalisam a clivagem oxidativa de ligações C-C entre grupos hidroxila fenólicos adjacentes utilizando catecóis como substratos. Esta classe de enzimas é bem caracterizada em bactérias, onde catalisam a degradação de compostos aromáticos. Na maioria das plantas Caryophyllales, como a beterraba, primavera e a maravilha, L-3,4-diidroxifenilalanina (L-DOPA) extradiol dioxigenases (DODAs) catalisam a clivagem oxidativa de L-DOPA na posição 4,5 gerando o ácido betalâmico, aldeído precursor das betalaínas, uma classe de pigmentos naturais que substitui as antocianinas na pigmentação dessas espécies. Alguns fungos basidiomicetos também produzem betalaínas, como o agário-das-moscas (Amanita muscaria). Nesse organismo, DODA é capaz de catalisar uma clivagem adicional na posição 2,3 da L-DOPA, formando muscaflavina, um isômero do ácido betalâmico que dá origem a uma outra classe de pigmentos naturais: as higroaurinas. Desde a caracterização do gene dodA, o qual codifica para a DODA de A. muscaria (AMAMU), não existem relatos na literatura que explorem a promiscuidade catalítica desta enzima, sua relação com outras linhagens de DODAs e a síntese quimioenzimática de betalaínas a partir desta enzima. Dessa forma, buscamos contextualizar as relações filogenéticas e funcionais entre AMAMU e diferentes linhagens de DODAs, bem como estabelecer um método que viabilize a clonagem, expressão heteróloga e caracterização funcional destaenzima. As análises filogenéticas revelaram que AMAMU possui uma evolução convergente com DODAs de plantas e bactérias e que, apesar de AMAMU ser funcionalmente homóloga à DODA da bactéria Escherichia coli, esta última apresenta homologia com DODAs de plantas. Logo, não há uma relação direta entre a sequência primária de DODAs e sua função. Nós também demonstramos que não há uma relação entre a expressão de transcritos de BvDODA1, e de seu parálogo BvDODA2, e a diferença de pigmentação entre variedades de beterrabas amarelas e vermelhas. A clonagem da sequência codificadora (CDS) publicada para o gene dodA de A. muscaria resultou na retenção do primeiro íntron, o que impedia a sua expressão. Então, uma nova CDS de 558 nucleotídeos foi proposta para este gene, a qual inclui um códon de início da tradução que se mantém na fase de leitura e codifica para uma proteína de 185 resíduos, 43 a menos que AMAMU. A expressão desta CDS resultou na proteína recombinante AmDODA, capaz de catalisar a síntese de ácido betalâmico e muscaflavina a partir de L-DOPA e D-DOPA. AmDODA possui um tamanho aproximado de 22 kDa, com um pH ótimo de atividade de 8,5 e uma constante de Michaelis (KM) de 3,7 ± 0,9 mmol L-1 e de velocidade máxima (Vmax) de 3,3 ± 0,4 µ mol min-1 mg-1. Sua utilização foi demonstrada na síntese quimioenzimática de betalaínas-modelo com potencial aplicação como sondas para microscopia confocal de fluorescência de dois fótons. Neste contexto, esta Tese explora os aspectos moleculares, bioquímicos e biológicos da DODA do fungo A. muscaria e traz importantes contribuições acerca da pigmentação por betalaínas na natureza. / Extradiol dioxigenases are enzymes that catalyze the oxidative cleavage of C-C bonds between adjacent phenolic hydroxyl groups using catechols as substrates. This class of enzymes is well characterized in bacteria, where they catalyze the degradation of aromatic compounds. In most plants of the Order Caryophyllales, such as beet, paperflower and four o\'clock flower, L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) extradiol dioxygenases (DODAs) catalyze the oxidative 4,5-cleavage of L-DOPA generating the betalamic acid, an aldehyde precursor of the betalains, a class of natural pigments that replaces anthocyanins in the pigmentation of these species. Some basidiomycete fungi also produce betalains, such as the fly agaric (Amanita muscaria). In this organism, DODA is able to catalyze an additional 2,3-cleavage of L-DOPA, yielding muscaflavine, an isomer of betalamic acid that gives rise to another class of natural pigments: the hygroaurins. Since the characterization of the dodA gene, which encodes the A. muscaria DODA (AMAMU), there are no reports in the literature that explore the catalytic promiscuity of this enzyme, its relation to other DODAs and the chemoenzymatic synthesis of betalains from this enzyme. Thus, we seek to contextualize the phylogenetic and functional relationships between AMAMU and different DODA lineages, as well as to establish a method that enable the cloning, heterologous expression and functional characterization of this enzyme. Phylogenetic analysis revealed that AMAMU has a convergent evolutionwith plant and bacterial DODAs and that although AMAMU is functionally homologous to the DODA of the Escherichia coli bacteria, this latter is homologous to the plant DODAs. Therefore, there is no direct relationship between the primary sequence of DODAs and their function. We have also shown that there is no relationship between the expression of BvDODA1 transcripts, and its BvDODA2 paralogue, and the pigment difference between yellow and red beet varieties. Cloning of the published coding sequence (CDS) for the dodA gene of A. muscaria resulted in the retention of the first intron, which prevented its expression. Then, a new CDS of 558 nucleotides was proposed for this gene, which includes a translation start codon that remains in the open reading frame and encodes for a protein 185 residues long, 43 less than AMAMU. Expression of this CDS resulted in the recombinant AmDODA protein, able to catalyze the synthesis of betalamic acid and muscaflavine from L-DOPA and D-DOPA. AmDODA has an approximate size of 22 kDa, with an optimum activity pH of 8.5 and a Michaelis constant (KM) of 3.7 ± 0.9 mmol L-1 and a maximum velocity (Vmax) of 3.3 ± 0.4 µmol min-1 mg-1. Its use was demonstrated in the chemoenzymatic synthesis of betalains-model with potential application as probes for confocal microscopy of two-photon fluorescence. In this context, this thesis explores the molecular, biochemical and biological aspects of the DODA of the fungus A. muscaria and brings important contributions about the pigmentation by betalains in nature.

Os inibidores de BRAF (iBRAFs) e de MEK (iMEK), inauguraram uma nova classe de medicamentos, a terapia direcionada, no combate ao melanoma metastático. Entretanto, os pacientes adquirem resistência ao tratamento em poucos meses. Além disso, a imunoterapia vem ganhando espaço no tratamento do câncer, incluindo o melanoma, porém, com alguns aspectos inexplorados. Dentro deste tema, a enzima IDO vem despertando um grande interesse pela participação nos mecanismos de imunotolerância, imunoescape e progressão tumoral. A IDO é responsável pelo consumo e depleção do triptofano, produzindo a quinurenina. Ela está presente em diversos tipos celulares, incluindo células do sistema imune e células tumorais. Este trabalho objetivou avaliar a expressão de IDO durante a progressão da doença - desde do nevo até o melanoma metastático e também avaliar a regulação de IDO induzido por IFN-γ após tratamento com iBRAF em linhagens parentais e resistentes ao iBRAF, buscando-se os mecanismos moleculares. Por fim, objetivou-se entender os efeitos do 1-metil-triptofano (1-MT), um inibidor de IDO, tanto na sua capacidade de inibir a atividade de IDO quanto na sua influência na capacidade clonogênica. O estudo de bioinformática sobre o repositório público GSE12391 mostrou que o nível de expressão gênica de IDO foi superior nos estágios mais avançado da doença. Além disso, todas amostras de melanoma primário de pacientes apresentaram a imunomarcação de IDO, enquanto que nenhuma amostra de nevo apresentou tal marcação. Adicionalmente, a ocorrência de IDO se deu nos infiltrados linfoides, em células mononucleares do sistema imune. Duas análises de bioinformática de expressão gênica demonstraram que a IDO estava expressa positivamente na fase de resistência ao iBRAF. Ademais, os resultados de expressão proteica mostraram que a inibição de via MAPK (tanto por iBRAF quanto por iMEK) conseguiu modular a expressão de IDO, sendo que a maioria das linhagens apresentou uma diminuição de IDO. A atividade de IDO, medida através da produção de quinurenina, por HPLC se mostrou em consonância com os resultados de expressão proteica, exceto pela linhagem WM164 que não apresentou atividade enzimática, embora a proteína estivesse presente. Por fim, o 1-MT conseguiu inibir de maneira eficiente a enzima IDO, bloqueando a produção de quinurenina. Além de que, o 1-MT reduziu a capacidade clonogênica de maneira dose-dependente. Portanto, conclui-se que a expressão de IDO é crescente conforme a progressão do melanoma, que a inibição da via MAPK regulou a expressão de IDO e que o 1-MT reduz a capacidade clonogênica, além da sua função primária de inibir IDO / BRAF and MEK inhibitors (BRAFi and MEKi) has launched a new class of medication, the target therapy, to combat metastatic melanoma. Nevertheless, patients acquired resistance to the treatment in few months. Additionally, immunotherapy has been gaining space in cancer treatment, including melanoma, but some aspects need to be explored. Inside this theme, IDO enzyme has called the attention due to its participation in the mechanisms of immune tolerance, scape and tumor progression. IDO is responsible for tryptophan consume e depletion, producing kynurenine. It is present in different cells, including cells from immune system and tumor cells. This work purposed evaluate IDO expression during disease progression - since nevus until metastatic melanoma and also, evaluate IFN-γ-induced IDO regulation after BRAFi treatment in parental and resistant melanoma cell lines, seeking the molecular mechanisms. Lastly, it was evaluated the effects of 1-methyltryptopahn (1-MT), an IDO inhibitor, by its ability to inhibit IDO and also by its influency on the clonogenic capability. Bioinformatic study performed on GSE12391 showed that gene expression level of IDO was superior in the most advanced stages of the disease. Additionally, all sample of patient\'s primary melanoma presented IDO immunostaining, whereas, no nevus samples presented such staining. Besides, IDO occurrence was in the lymphoid infiltrates, in mononuclear cells from immune system. Two bioinformatic analysis of gene expression demonstrated that IDO was differentially overexpressed during BRAFi resistance stage. Moreover, protein expression results presented that MAPK pathway inhibition (both by BRAFi and by MEKy) was able to modulate IDO expression, and most of the cell lines presented an IDO downregulation. IDO activity, measured through kynurenine production, by HPLC was consonant with protein expression results, except by WM164 cell line, which did not present enzymatic activity, albeit the protein was present. By the end, 1-MT could inhibit efficiently IDO enzyme, blocking kynurenine production. Furthermore, 1-MT reduced clonogenic capability in a dosedependent manner. Therefore, it was concluded that IDO expression increases along with melanoma progression, MAPK pathway inhibition regulated IDO expression and 1-MT reduced clonogenic capability, besides its primary function of IDO inhibitor.

O diabetes mellitus (DM) em longo prazo pode levar a diversos problemas entre eles a insuficiência renal, cegueira, alterações vasculares e neurológicas. Entre as teorias que explicam como a hiperglicemia crônica conduz aos danos celulares e teciduais responsáveis pelas complicações observadas no DM, a formação dos produtos finais de glicação avançada (AGEs) é considerada uma das mais importantes. Sabe-se também que nas doenças cardiovasculares, uma das principais complicações do diabetes, ocorre um aumento das quinureninas, produtos de oxidação do triptofano, numa reação catalisada pela enzima Indolamina 2,3 dioxigenase (IDO). Neste trabalho avaliamos a influência dos AGEs sobre a modulação da enzima IDO no estado diabético e seu impacto nos principais marcadores de risco cardíaco. Foi utilizado um modelo experimental de diabates induzido pela injeção i.p. de aloxano em ratos Wistar que foram divididos em 6 grupos (n=8 por grupo): Diabético Ativado (DA), Diabético Não Ativado (DNA), Diabético Ativado tratado com aminoguanidina (DAAG), Diabético Não Ativado tratado com AG (DNAAG), Controle Ativado (CA) e Controle Não Ativado (CNA). A aminoguanidina (AG) é um conhecido inibidor da formação de AGEs e foi administrada por gavagem por 50 dias após a instalação do DM. A formação de quinureninas reflete a atividade de IDO e foi medida em macrófagos peritoneais e homogenato de cérebro, por HPLC. A expressão de IDO foi avaliada por Dot blot, imunofluorescência e imunocitoquímica. Os principais marcadores de risco cardíaco (colesterol total e suas frações e PCR-US) foram determinados através de kits comerciais. Além disso, foi avaliado também o perfil glicêmico e renal destes animais, uma vez que os AGEs são nefrotóxicos. Como esperado, no estado diabético houve um aumento de 2,9 vezes na formação dos AGEs, em relação aos animais controle e a aminoguanidina inibiu cerca de 35% da formação destes produtos. Observamos um aumento na atividade e expressão de IDO em macrófagos e homogenato de cérebro de ratos diabéticos em relação ao controle. O aumento visto em macrófagos foi mais evidente quando estas células foram ativadas pelo LPS, mimetizando uma situação de infecção. Este aumento ocorreu de forma independente da concentração dos AGEs, uma vez que não houve diferença entre os grupos tratatos e não tratados pela AG. Da mesma forma observada para a modulação da IDO, o tratamento com a AG não alterou os perfis glicêmico, lipídico e renal no nosso modelo experimental. Nossos resultados demonstram que o estado hiperglicêmico eleva os níveis de IDO. Estes achados sugerem que IDO pode vir a se tornar um marcador da morbidade do diabetes e potencial alvo em novas estratégias terapêuticas para o DM. / The diabetes mellitus (DM) is a chronic disease that is known to cause several longterm complications such as renal insufficiency, blindness, vascular and neurological changes. There are some theories trying to explain how chronic hyperglycemia may lead to cellular and tissue impairments and the Advanced Glycation End-Products (AGE) theory is one of the most important. Cardiovascular disease is one of the diabetes mellitus long-term complications and in this case it was observed an increased serum concentration of kynurenine, an indoleamine 2, 3 dioxygenase (IDO) catalyzed tryptophan oxidation product. In this study we evaluated the IDO modulation by AGEs in diabetic rats and the impact of this modulation in cardiac risk markers. For diabetes model, Wistar rats were treated with intraperinoeal (i.p.) injection of aloxane. It was evaluated 6 different groups (n=8): Activated diabetic (DA), Non Activated diabetic (DNA), Activated diabetic treated with aminoguanidine (DAAG), Non activated diabetic treated with aminoguanidine (DNAAG), Activated control (CA) and Non activated control (CAN). Aminoguanidine (AG) is a known AGEs formation inhibitor and it was administrated by gavage during 50 days after the DM was installed. Kynurenine formation is a measure of IDO acitivity and it was evaluated, by HPLC, in peritoneal macrophages and brain homogenates. The IDO protein expression was analyzed by Dot Blot, Immunofluorescence and immunocytochemistry. The main cardiac risk markers (total cholesterol and fractions and PCR-US) were determined by commercial kits. The glycemic and renal profile were also evaluated since AGEs are known to be nephrotoxic. As expected, we observed an increase in AGEs by 2,9 times when compared with the control and the aminoguanidine compound inhibited 35% of tthese products. There was an increase in the IDO expression and activity in macrophages and brain homogenates in diabetic rats when compared with control. This rise was more evident when the animals were treated with LPS, mimicking an infection. The difference of IDO activity and expression was not due to the AGEs concentration since we did not observe difference between the AG treated and non-treated groups. The same way observed by IDO modulation, the AG treatment did not alter the glycemic, lipidic and renal profiles in this experimental model. These results showed that the hyperglycemic state increase IDO levels. These findings suggest that IDO might be a morbid diabetes marker and a potential target of new therapeutic strategies of DM. / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG

A indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO) desempenha um papel importante na tolerância materno-fetal devido á sua ação de catabolizar o triptofano e, consequentemente, impedir a proliferação de linfócitos T, que necessitam desse aminoácido para se manter. Hormônios da reprodução também participam do processo de sobrevivência do feto alogênico, como a progesterona que bloqueia o estímulo mitogênico da proliferação de células T, modula a produção de anticorpos, favorece a produção de IL-10, etc. e o estradiol, que pode modular o perfil imune Th1 ou Th2 na gestação, dependendo de sua concentração. Contudo, a existência ou não de correlação da ação da IDO com esses hormônios ou vice-versa ainda encontra-se pouco evidenciada. Desta forma este trabalho verificou a influência da expressão da IDO e às ações de hormônios da reprodução e citocinas no ciclo celular de células oriundas de fetos e placenta de gestação a termo de fêmeas de ratas e camundongos em cultivo. Este estudo foi realizado em complementação a um trabalho anterior, no qual foi realizada uma avaliação da expressão da IDO por citometria de fluxo em células uterinas, de placentas e de embriões de ratas e camundongos fêmeas prenhes e não prenhes que foram mantidas em cultivo e suplementadas com estradiol, progesterona, interferon γ, triptofano e 1-metil-DL- triptofano. A avaliação das fases do ciclo celular foi realizada pela citometria de fluxo. De acordo com os resultados, em relação ao efeito dos tratamentos no comportamento das células no ciclo celular, podemos observar que, em ratas prenhes e não prenhes, ao adicionar estradiol, houve maior predominância das células em fase G1 nos períodos de 4 e 24 horas, bem como no grupo de camundongos fêmeas prenhes. Algumas células uterinas de ratas não prenhes tratadas com estradiol, assim como as tratadas com progesterona e interferon γ progrediram no ciclo para fase de síntese nos tempos de 24 e 48 horas. Com a adição de triptofano podemos notar nos grupos de ratas não prenhes, camundongos fêmeas prenhes e não prenhes, um aumento da quantidade de células na fase G1 nos três períodos analisados. No grupo de ratas prenhes foi observado uma predominância celular em fase G1 nos tempos de 4 e 24 horas, sendo que em 48 horas, as células sofreram fragmentação de DNA. As células que foram suplementadas com 1- metil DL - triptofano + triptofano mantiveram o mesmo comportamento no ciclo celular , se mantendo em fase G1 nos tempos de 4, 24 e 48 horas grupos prenhes e não prenhes de ratas e nos tempos de 4 e 24 horas nos grupos de camundongos fêmeas prenhes e não prenhes, estando com seu DNA fragmentado e em fase de síntese, respectivamente, no tempo de 48 horas. A suplementação dos diversos fatores aos cultivos celulares permitiu observar alterações na dinâmica do ciclo celular, representada principalmente por um aumento de células em fase G1 nos grupos de células placentárias e embrionárias que receberam progesterona, estradiol, interferon γ e triptofano e apresentaram um significativo aumento da expressão de IDO, e que permite inferir que provavelmente a síntese de RNAm esteja correlacionada à produção da IDO. / The indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) plays an important role in maternal-fetal tolerance due to its capacity to catabolize tryptophan and thereby preventing the proliferation of T lymphocytes, necessary for their maintenance. Reproductive hormones are also involved in the process of survival of semi-allogeneic fetus, as progesterone that blocks mitogenic stimulation of T cell proliferation, modulates antibodies production, promotes production of IL-10, etc. and estradiol, that can modulate the Th1 or Th2 immune profile during pregnancy, depending on its concentration. However, there is very few evidences regarding a possible correlation between IDO expression and these hormones; thus this study examined the influence of the expression of IDO and the actions of reproductive hormones and cytokines in the cell cycle of cells derived from fetuses and placenta at term gestation of female rats and mice in culture. This study was conducted as a complement to an earlier work, in which an evaluation was made of the IDO expression by flow cytometry in uterine cells, placentas and embryos of pregnant rats and mice and non-pregnant females that were maintained in culture and supplemented with estradiol, progesterone, interferon γ, tryptophan and 1-methyl-DLtryptophan. The cell cycle evaluation was conducted by flow cytometry. According to the results, regarding the effect of treatments on the behavior of the cells in the cell cycle, it was observed that in pregnant and non-pregnant rats after the addition of estradiol, there is a greater predominance of cells in G1 phase at periods of 4 and 24 hours, that also was noted in the group of pregnant female mice. Uterine cells from non-pregnant female rats treated with estradiol and progesterone as well as treated with interferon γ progressed to the phase of synthesis on the cycle, at 24 and 48 hours. With the addition of tryptophanin the groups of non-pregnant rats, pregnant and non-pregnant mice , an increased amount of cells in the G1 phase were observed in the three periods analyzed. In the group of pregnant rats a predominance of cells in the G1 phase was observed in periods of 4 and 24 hours, and 48 hours, where the cells undergone DNA fragmentation. In pregnant and non-pregnant rats the cells supplemented with 1 - methyl - DL - tryptophan + tryptophan remained at G1 phase in periods of 4, 24 and 48 hours and 4 and 24 hours for cells from pregnant and non-pregnant mice , that show ragmented DNA followed by synthesis at 48 hours period. Supplementation of the various factors to cell cultures allowed to observe dynamic changes in the cell cycle, represented primarily by an increase of cells in G1 phase in groups of embryonic and placental cells that received progesterone, estradiol, interferon γ and tryptophan and showed a significant increase in the expression of IDO, that allows us to infer that the mRNA synthesis is probably correlated to the production of IDO.

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A resposta imune sistêmica contra o parasito é tipicamente do perfil Th1, com síntese de citocinas próinflamatórias, principalmente IFN, responsável pela redução da proliferação parasitária. Por outro lado, este perfil de resposta modifica-se durante o período gestacional, em que o balanço da resposta Th1 e Th2 aparentemente favorece a sobrevivência do concepto. Semelhante a isto, observa-se o mesmo padrão de resposta no sistema nervoso central (SNC), local de encistamento do parasito. Estudos anteriores apontaram que IDO (indolamina 2,3 dioxigenase) é modulada por IFN e que participa no controle da proliferação parasitária. Em estudos de neuroinflamação usando co-culturas de células gliais/neurônios infectadas por N. caninum, observou-se controle da proliferação parasitária por um mecanismo independente da enzima óxido nítrico sintase induzida por IFN. No interesse de esclarecer o mecanismo de controle parasitário neste modelo in vitro, a atividade da IDO e da ciclooxigenase 2 (COX-2) foram estudas. Co-culturas celulares glia/neurônios obtidas de ratos foram tratadas com o inibidor da IDO (1-metil triptofano/10-3M/mL) e com inibidores da COX-1 (indometacina10-6 M/mL) e da COX- 2 (nimesulida/10-6 M/mL) antes da infecção com taquizoítos de N.caninum (1:1 célula:parasito). Após 72 horas de infecção, as atividades enzimáticas foram avaliadas e seus fenótipos foram determinados usando anticorpos anti-βIII tubulin, OX-42 and GFAP para observar neurônios, microglia e astrócitos respectivamente. O perfil da resposta imunológica foi determinado por dosagem das citocinas IL-10, IFN e TNF pelo ensaio de ELISA. Notou-se duas vezes mais o aumento na atividade da enzima IDO em co-culuturas infectadas pela dosagem de cinurenina. Em culturas tratadas com o inibidor da IDO (1-MT) e infectadas com taquizoitos ocorreu aumento na proliferação parasitária de aproximadamente 40%, bem como aumento na atividade da IDO. Pertinente a atividade da COX-2, culturas infectadas produzem PGE2, enquanto tratamento com nimesulida permite o crescimento parasitário e induz perda de aproximadamente 30% e 50% de astrócitos e microglia respectivamente, no entanto os neurônios foram preservados. A infecção por taquizoítos promove síntese de IL-10 e TNF, ainda na presença do inibidor da IDO, mas não ocorre liberação de IFN. Estes dados indicam que neste modelo experimental a atividade da IDO é ativada por um mecanismo independente IFN e que o controle parasitário pode ser mediado pelo efeito sinérgico de PGE2 e TNF. Assim, a ativação da COX-2 parece ser um importante via de controle, ao passo que PGE2 associada a IL-10 podem modular a inflamação e permitem a continuidade do parasitismo. / Neospora caninum is an obligate intracellular protozoan that has been very studied by Veterinary Medicine because it causes neuromuscular disorders in dogs and abortion in cattle. The protective systemic immune response against this parasite is predominantly Th1 pattern, which there is proinflammatory cytokines production, mainly IFN, responsible for reduction of parasite burden. However, this response profile appears to be modified during pregnancy in chronically infected animals, in which a balance of production of Th1 and Th2 cytokines appears to favors fetal survival. The same was suggested occur in the central nervous system (CNS), local of parasite encystment. Previous data showed that IDO (indolamine 2,3 dioxygenase) is modulated by IFN in cell proliferation control. In studies of neuroinflammation using neuro-glia co-cultures infected by Neospora caninum, it was verified parasite control by a mechanism independent of type 2 nitric oxide synthetase (iNOS) induced by IFN. In order to clarify the mechanism of parasite control in this in vitro model, the activities of IDO and cyclooxygenase 2 (COX-2) were studied. Co-cultures of glia/neuron obtained from rat brains were treated with the inhibitor of IDO (1-methyl tryptohan/10-3M/mL) and with inhibitors of COX-1 (indomethacin/10-6 M/mL) and COX-2 (nimesulide/10-6 M/mL) before infection with tachyzoites of N.caninum (1:1 cell:cell). After 72 hours enzymes activities were evaluated and cell phenotypes determinate using βIII tubulin, OX-42 and GFAP to observe neurons, microglia and astrocytes respectively. Immunological profile of response was determinate by ELISA tests of IL-10, IFN and TNF. It was verified that parasite infection in co-cultures increased twice IDO activity measured by kinurenin releasing. In cultures treated with IDO inhibitor 1-MT and infected with tachyzoites it was verified about 40% of parasite proliferation and an increasing of enzyme activity. Concerning to COX-2 activity, infected cultures stimulated the release of PGE2, while nimesulide allowed the parasitic growth and a lost of 30 or 50% of astrocytes and microglia respectively, however was preserved neurons in cultures infected. Infection increases IL-10 and TNF even upon IDO inhibition but it does not release IFN. These data indicate that in this in vitro system IDO is activated by a mechanism independent of IFNy and parasite control could be mediated by synergistic effects of PGE2 and TNF. In fact, COX-2 activation seems to be an important via in parasite control and PGE2 associated to IL-10 besides to modulate the inflammation, allows continuity of parasitism.

Foram isoladas neste trabalho seis bactérias a partir de serragem de couro contaminado com fenol, proveniente de um curtume da região de estudo. Elas foram identificadas como Pseudomonas putida, Microbacterium oxydans, Stenotrophomonas maltophilia e Sthaphylococcus cohnii utilizando-se a técnica do 16 S ribossomal. Os isolados de M. oxydans (BLB-2 e BLB-4) foram utilizados nos estudos posteriores, onde se verificou que ambos apresentavam alta capacidade de remoção e tolerância ao fenol, até a concentração de 750 e 1000 mg L-1, respectivamente. Ao longo do trabalho, a bactéria BLB-4 perdeu a capacidade degradativa sendo esta reisolada do inóculo utilizando-se a técnica de conjugação. Após esta etapa foi realizado estudo das condições de cultivo, onde se verificou que utilizando meio mineral com peptona, juntamente com uma concentração maior de inoculo, no pH 7,0, havia um aumento da taxa de remoção de fenol. A bactéria voltou a tolerar a mesma concentração que tolerava antes de perder a capacidade degradativa (1000 mg L-1). Foi constatado que ambas as bactérias utilizavam a via de degradação orto-β-cetoatipato, expressando as enzimas fenol hidroxilase e catecol 1,2-dioxigenase. Verificou-se que todas eram termoestáveis, atuavam em uma grande faixa de pH (4,0 a 9,0), que algumas foram afetadas pela presença de íons metálicos no meio de reação, como o mercúrio. Os resultados apresentados neste trabalho sugerem que ambas as bactérias e suas enzimas são promissoras para serem utilizadas em processos de biorremediação. / Were isolated in this study six bacteria from leather shavings contaminated with phenol, from a tannery in the region of study. They were identified as Pseudomonas putida, Microbacterium oxydans, Stenotrophomonas maltophilia and Staphylococcus cohnii using the technique of the 16 S ribosomal RNA. The isolates of M. oxydans (BLB-2 and BLB-4), were used in others subsequent studies, which found that both bacterias had a high removal capacity and tolerance to phenol concentrations of up to 750 and 1000 mg L-1, respectively. Throughout the work, the bacteria BLB-4 lost the ability of degradation, so was used the technique of conjugation to isolation of the bacteria of the inoculum. After, was made the study of culture conditions, where it was found that mineral medium with peptone, a higher concentration of inoculum and the pH 7.0, increased rate of removal of phenol. The bacteria tolerated the same concentration as tolerated before losing degrading capacity (1000 mg L-1). Was found that both the bacteria used the route of degradation of ortho-β-cetoatipato, expressing the enzymes phenol hydroxylase and catechol 1,2-dioxygenase. It was found that all were heatstable, worked in a wide range of pH (4.0 to 9.0), some were affected by the presence of metal ions in the reaction medium, such as mercury. The results presented in this study suggest that both bacteria and their enzymes are promising for use in bioremediation processes.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense - UNESC, para a obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. / Estudos demonstraram que a exposição a um ambiente adverso no início da vida pode estar relacionado à vulnerabilidade para o desenvolvimento posterior do transtorno depressivo maior (TDM). A privação materna (PM) induz mudanças comportamentais e afeta os circuitos cerebrais que podem estar associados à fisiopatologia do TDM. Assim, este estudo teve como objetivo investigar os papéis que a micróglia, os astrócitos e a indoleamina 2, 3-dioxigenase (IDO) desempenham em diferentes períodos do desenvolvimento seguido da PM no ínicio da vida. Os tempos de imobilidade no teste de nado forçado (TNF) foram avaliados nos dias pós-natais (PND) 20, 30, 40 e 60. A técnica de imuno-histoquímica foi utilizada no PND 10, 20, 30, 40 e 60 para investigar alterações induzidas pelo PM no hipocampo através da proteína glial fribrilar ácida (GFAP), um marcador de astrócito, e da molécula adaptadora ligante de cálcio ionizado-1 (Iba-1), um marcador de microglia. Além disso, nos mesmos PND, utilizou- se RT-PCR em tempo real para investigar alterações induzidas pela PM na expressão de GFAP, IDO e AIF-1, um marcador de microglia, no do córtex frontal (CF) e no hipocampo. Os resultados demonstraram que não houve alteração nos tempos de imobilidade nos PND 20, 30 ou 40. No entanto, no PND 60, os ratos submetidos à PM exibiram um comportamento depressivo como demonstrado pelo aumento no tempo de imobilidade. Os níveis de células imunopositivas de GFAP não mudaram nos PND 10 ou 30. No PND 20, os níveis de células imunopositivas de GFAP diminuíram em ratos submetidos à PM. Foi observado um aumento na expressão de células imunopositivas de GFAP nos PND 40 e 60 em ratos privados de mãe. Verificou-se que os níveis de Iba-1 aumentaram em PND 10, 20 e 30. Não houve alteração nos níveis de células imunopositivas para Iba-1 nos PND 40 ou 60. A expressão de IDO foi reduzida no hipocampo no PND 10, e elevada no CF no PND 60 após a PM. A expressão de GFAP por RT-PCR diminuiu no CF no PND 10, e verificou-se que aumentou no hipocampo no PND 60 nos ratos privados de mãe. A expressão de AIF-1 aumentou no CF nos PND 20 e 60 após a PM. Em conclusão, os resultados sugerem que o estresse no início da vida induz alterações negativas no desenvolvimento de ratos, evidenciado por comportamento depressivo na vida adulta. Além disso, a PM aumentou a ativação microglial nas fases precoces e tardias do desenvolvimento. Os níveis de GFAP e IDO diminuíram nos estágios iniciais, mas foram aumentados em períodos tardios. Esses achados sugerem que a PM pode afetar diferencialmente a expressão da enzima IDO, além das células astrocitárias e microgliais. O início de um estado inflamatório a partir de células cerebrais pode estar associado à ativação da via da quinurenina, através da expressão alterada de IDO, e ao desenvolvimento do comportamento depressivo na idade adulta.