A enzima glicossomal gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) de Tripanosoma cruzi e os mutantes D210L e D210L-G213D foram expressos em E. coli, purificados e submetidos a ensaios de cinética enzimática e de cristalização. A enzima GAPDH tipo selvagem e o mutante D210L-G213D cristalizaram-se no grupo espacial P21 e os cristais apresentaram padrões de difração de raios-X de boa qualidade. A estrutura cristalográfica da enzima tipo selvagem foi determinada a 2.5 e 2.15 A de resolução, a partir de coletas de dados realizadas a 277 e 100 K respectivamente. Os fatores R cristalográficos finais dos refinamentos foram de 16.0% para a estrutura a 277 K e 18.8% para a estrutura a 100 K. A estrutura do mutante GAPDH D210L-G213D foi determinada a 2.15 A de resolução e refinada até um fator R cristalográfico de 18.9%. A comparação entre as estruturas da enzima tipo selvagem determinadas nas duas temperaturas levou a resultados interessantes no que diz respeito ao empacotamento cristalino. O resfriamento dos cristais provocou uma redução no volume da cela unitária de 10.5%, tendo a maior variação ocorrido no parâmetro de rede a (14.5%). A sobreposição das celas unitárias mostrou uma rotação do conteúdo da unidade assimétrica de cerca de 5 graus em torno de um eixo aproximadamente paralelo a b. Por outro lado, a análise das estruturas da enzima tipo selvagem e mutante, juntamente com os parâmetros cinéticos, permitiram a discussão a respeito de alguns detalhes do mecanismo catalítico da enzima, principalmente no que se refere ao papel do resíduo Arg249. Tal resíduo, que apresenta grande mobilidade conformacional de sua cadeia lateral, parece estar envolvido na etapa de reorientação de um dos intermediários durante o processo catalítico. / The glycosomal glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) from Typanosoma cruzi and its mutants D210L and D210L-G213D were expressed in E. coli and purified, followed by kinetic and crystallization assays. Both wild type enzyme and D210L-G213D mutant were crystallized in P21 space group and the crystals presented good X-ray diffraction patterns. The three-dimensional structure of the wild type enzyme was determined at 2.5 and 2.15 A resolution from data collected at 277 and 100 K respectively. The structures were refined to a crystallographic R-factor of 16.0% for data collected at 277 K and 18.8% for those collected at 100 K. Also, the structure of the D210L-G213D mutant was solved at 2.15 A resolution and refined to a crystallographic R-factor of 18.9% with good geometry indicators. Comparison between the wild type enzyme structures solved at both temperatures led to interesting results concerning the crystal packing. Flash-cooled crystals presented a 10.5% shrink in the unit cell volume being the major reduction observed in the parameter a (14.5%). Superposition of the unit cells showed a global rotation of the asyrnmetric unit content of about 5 degrees around an axis approximately parallel to b. On the other hand, the analysis of the wild type and mutant enzyme structures, together with the kinetic parameters, allowed a discussion about some catalytic mecanism details, mainly the role of the Arg249 residue. The results showed that this residue might be involved in the reorientation of one of the intermediates during the catalytic process.

A enzima glicossomal gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) de Tripanosoma cruzi e os mutantes D210L e D210L-G213D foram expressos em E. coli, purificados e submetidos a ensaios de cinética enzimática e de cristalização. A enzima GAPDH tipo selvagem e o mutante D210L-G213D cristalizaram-se no grupo espacial P21 e os cristais apresentaram padrões de difração de raios-X de boa qualidade. A estrutura cristalográfica da enzima tipo selvagem foi determinada a 2.5 e 2.15 A de resolução, a partir de coletas de dados realizadas a 277 e 100 K respectivamente. Os fatores R cristalográficos finais dos refinamentos foram de 16.0% para a estrutura a 277 K e 18.8% para a estrutura a 100 K. A estrutura do mutante GAPDH D210L-G213D foi determinada a 2.15 A de resolução e refinada até um fator R cristalográfico de 18.9%. A comparação entre as estruturas da enzima tipo selvagem determinadas nas duas temperaturas levou a resultados interessantes no que diz respeito ao empacotamento cristalino. O resfriamento dos cristais provocou uma redução no volume da cela unitária de 10.5%, tendo a maior variação ocorrido no parâmetro de rede a (14.5%). A sobreposição das celas unitárias mostrou uma rotação do conteúdo da unidade assimétrica de cerca de 5 graus em torno de um eixo aproximadamente paralelo a b. Por outro lado, a análise das estruturas da enzima tipo selvagem e mutante, juntamente com os parâmetros cinéticos, permitiram a discussão a respeito de alguns detalhes do mecanismo catalítico da enzima, principalmente no que se refere ao papel do resíduo Arg249. Tal resíduo, que apresenta grande mobilidade conformacional de sua cadeia lateral, parece estar envolvido na etapa de reorientação de um dos intermediários durante o processo catalítico. / The glycosomal glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) from Typanosoma cruzi and its mutants D210L and D210L-G213D were expressed in E. coli and purified, followed by kinetic and crystallization assays. Both wild type enzyme and D210L-G213D mutant were crystallized in P21 space group and the crystals presented good X-ray diffraction patterns. The three-dimensional structure of the wild type enzyme was determined at 2.5 and 2.15 A resolution from data collected at 277 and 100 K respectively. The structures were refined to a crystallographic R-factor of 16.0% for data collected at 277 K and 18.8% for those collected at 100 K. Also, the structure of the D210L-G213D mutant was solved at 2.15 A resolution and refined to a crystallographic R-factor of 18.9% with good geometry indicators. Comparison between the wild type enzyme structures solved at both temperatures led to interesting results concerning the crystal packing. Flash-cooled crystals presented a 10.5% shrink in the unit cell volume being the major reduction observed in the parameter a (14.5%). Superposition of the unit cells showed a global rotation of the asyrnmetric unit content of about 5 degrees around an axis approximately parallel to b. On the other hand, the analysis of the wild type and mutant enzyme structures, together with the kinetic parameters, allowed a discussion about some catalytic mecanism details, mainly the role of the Arg249 residue. The results showed that this residue might be involved in the reorientation of one of the intermediates during the catalytic process.

Made available in DSpace on 2017-07-10T19:24:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mariana_ sbizzaro.pdf: 1501907 bytes, checksum: 5610159e30f98d52848320f90146f751 (MD5) Previous issue date: 2016-02-12 / The agricultural sector has great influence in Brazilian economy. Furthermore, agricultural yield has been associated with pesticides application during crop cycle, which atrazine is applied for example, since it can cause environmental contamination when it does not reach its target. Thus, there are some essential and imperative options that can minimize contamination and negative impacts during agricultural practices. So, present study aimed at evaluating the ability of three biochars in atrazine adsorption. Therefore, three biochars produced from bamboo culm were used, whose species is Phyllostachys aurea, and temperature ranged at 350 ºC, 450 ºC and 550 ºC. The three studied biochars were named as BE350, BE450 and BE550. They were characterized based on their physical and chemical properties by elemental analysis, characterization of functional groups (Infrared Spectroscopy Fourier Transform - FTIR), surfaces morphology evaluation (Scanning Electron Microscopy - SEM) as well as specific surface area (ASEBET) and porosity. A kinetic study was carried out to determine the equilibrium period of adsorption process and the kinetic mechanism that controls such process. Langmuir and Freundlich isotherms were also modeled during this trial. Atrazine determination, after the adsorption test, was carried out by High Performance Liquid Chromatography (HPLC). The obtained analyses showed that the adsorption capacity of biochars decreased in the following order: BE 450> BE 350 > BE 550, and such capacity has been associated with the physical and chemical characteristics of biochars. The three studied biochars are well represented by the kinetic model of pseudo-second order. At last, all biochars have shown high affinity to adsorb atrazine; however, the biochar that was produced at 450 ºC has shown the highest adsorption capacity. / O setor agrícola possui grande destaque na economia brasileira, a produção agrícola está associada ao uso de pesticidas durante o ciclo das culturas, como é o caso da atrazina, que pode causar a contaminação do ambiente, quando não atinge seu alvo. Sendo assim, alternativas que minimizem as contaminações e impactos negativos da prática agrícola são essenciais e urgentes. Desta forma, o presente estudo teve por objetivo avaliar a capacidade de três biocarvões, em adsorver o herbicida atrazina. Para tanto, foram utilizados três biocarvões, produzidos a partir do colmo de bambu, da espécie Phyllostachys aurea à 350ºC, 450ºC e 550ºC, nomeados BE350, BE450 e BE550. Os biocarvões foram caracterizados quanto as propriedades físicas e químicas, por meio de análise elementar, caracterização de grupos funcionais (Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier - FTIR), avaliação da morfologia das superfícies (Microscopia Eletrônica de Varredura - MEV), bem como, área superficial específica (ASEBET) e porosidade. Estudo cinético foi realizado, visando determinar o tempo de equilíbrio do processo de adsorção, bem como, o mecanismo cinético que controla o processo. Também foram modeladas isotermas de Langmuir e Freundlich. A determinação da atrazina, após os ensaios de adsorção, foi realizada por Cromatografia Líquida de Alta Performance (CLAE). As análises realizadas apontaram que a capacidade de adsorção dos biocarvões diminuiu na ordem de BE 450 > BE 350 > BE 550, e tal capacidade está associada às características físicas e químicas dos biocarvões. Os três biocarvões são bem representados pelo modelo cinético de pseudo-segunda ordem. Todos biocarvões exibiram elevada afinidade para a adsorção do herbicida atrazina, contudo, o biocarvão produzido à 450 ºC demonstra maior capacidade de adsorção

Made available in DSpace on 2017-05-12T14:47:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mariana_ sbizzaro.pdf: 1501907 bytes, checksum: 5610159e30f98d52848320f90146f751 (MD5) Previous issue date: 2016-02-12 / The agricultural sector has great influence in Brazilian economy. Furthermore, agricultural yield has been associated with pesticides application during crop cycle, which atrazine is applied for example, since it can cause environmental contamination when it does not reach its target. Thus, there are some essential and imperative options that can minimize contamination and negative impacts during agricultural practices. So, present study aimed at evaluating the ability of three biochars in atrazine adsorption. Therefore, three biochars produced from bamboo culm were used, whose species is Phyllostachys aurea, and temperature ranged at 350 ºC, 450 ºC and 550 ºC. The three studied biochars were named as BE350, BE450 and BE550. They were characterized based on their physical and chemical properties by elemental analysis, characterization of functional groups (Infrared Spectroscopy Fourier Transform - FTIR), surfaces morphology evaluation (Scanning Electron Microscopy - SEM) as well as specific surface area (ASEBET) and porosity. A kinetic study was carried out to determine the equilibrium period of adsorption process and the kinetic mechanism that controls such process. Langmuir and Freundlich isotherms were also modeled during this trial. Atrazine determination, after the adsorption test, was carried out by High Performance Liquid Chromatography (HPLC). The obtained analyses showed that the adsorption capacity of biochars decreased in the following order: BE 450> BE 350 > BE 550, and such capacity has been associated with the physical and chemical characteristics of biochars. The three studied biochars are well represented by the kinetic model of pseudo-second order. At last, all biochars have shown high affinity to adsorb atrazine; however, the biochar that was produced at 450 ºC has shown the highest adsorption capacity. / O setor agrícola possui grande destaque na economia brasileira, a produção agrícola está associada ao uso de pesticidas durante o ciclo das culturas, como é o caso da atrazina, que pode causar a contaminação do ambiente, quando não atinge seu alvo. Sendo assim, alternativas que minimizem as contaminações e impactos negativos da prática agrícola são essenciais e urgentes. Desta forma, o presente estudo teve por objetivo avaliar a capacidade de três biocarvões, em adsorver o herbicida atrazina. Para tanto, foram utilizados três biocarvões, produzidos a partir do colmo de bambu, da espécie Phyllostachys aurea à 350ºC, 450ºC e 550ºC, nomeados BE350, BE450 e BE550. Os biocarvões foram caracterizados quanto as propriedades físicas e químicas, por meio de análise elementar, caracterização de grupos funcionais (Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier - FTIR), avaliação da morfologia das superfícies (Microscopia Eletrônica de Varredura - MEV), bem como, área superficial específica (ASEBET) e porosidade. Estudo cinético foi realizado, visando determinar o tempo de equilíbrio do processo de adsorção, bem como, o mecanismo cinético que controla o processo. Também foram modeladas isotermas de Langmuir e Freundlich. A determinação da atrazina, após os ensaios de adsorção, foi realizada por Cromatografia Líquida de Alta Performance (CLAE). As análises realizadas apontaram que a capacidade de adsorção dos biocarvões diminuiu na ordem de BE 450 > BE 350 > BE 550, e tal capacidade está associada às características físicas e químicas dos biocarvões. Os três biocarvões são bem representados pelo modelo cinético de pseudo-segunda ordem. Todos biocarvões exibiram elevada afinidade para a adsorção do herbicida atrazina, contudo, o biocarvão produzido à 450 ºC demonstra maior capacidade de adsorção