Made available in DSpace on 2014-10-09T12:35:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:06:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Dissertação (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

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As serino proteases participam de diversos processos fisiológicos (tal como o de coagulação) e patológicos. Essas enzimas estão amplamente distribuídas entre as espécies, são também toxinas dos venenos de serpentes, sendo denominadas SVSPs (snake venom serine proteases). Essas SVSPs são multifuncionais e contêm uma tríade catalítica formada pelos aminoácidos HDS. Algumas SVSPs são comercialmente disponíveis, sendo indicadas para o tratamento de infarto do miocárdio, tromboses e embolia pulmonar. No veneno de Crotalus durissus terrificus estão descritas até o momento, apenas duas SVSPs sendo que a mais estudada é a giroxina que representa cerca de 2,5% do veneno total. No presente estudo foi reportado a clonagem de sete serino proteases amplificadas a partir de uma biblioteca de cDNA de glândula de veneno de um único espécime adulto de Crotalus durissus terrificus. Estes clones foram analisados com relação à organização do cDNA, estrutura e prováveis funções. A construção do modelo tridimensional da giroxina permitiu verificar as similaridades com tripsina, trombina e outras SVSPs. A glicosilação e a presença de muitas pontes dissulfetos dificultam a obtenção das SVSP recombinantes na forma solúvel e com atividade, por expressão em E.coli. Assim, neste trabalho foi abordada a expressão em células de mamífero (que realiza as modificações pós-traducionais) com resultados promissores. Para tanto, o peptídeo sinal de Igk, a seqüência madura e a região 3 UTR da giroxina foram clonados no vetor pED, originando um novo vetor (pED-Giro). Este vetor carrega o peptídeo sinal de Igk, o que possibilitou a secreção da giroxina para o meio de cultura. O vetor pED-Giro foi transfectado em células CHO DXB11 dhfr e COS-7. A giroxina foi detectada no extrato total das células COS-7 por western blot e, em seguida, purificada do meio de cultura com coluna de afinidade (Benzamidina Sepharose) e demonstrado sua integridade pelo ensaio de atividade esterásica. / The serine proteases affect several physiological processes (such as the coagulation cascade) and pathological ones. These enzymes are widely distributed beyond the species; they are also toxins from snake venoms and are called SVSPs (snake venom serine proteases). These SVSPs are multifunctional and have a catalytic triad formed by HDS amino acids. Some of them are commercially available for use in clinical treatment for heart attack, tromboses and pulmonary embolism. So far, in Crotalus durissus terrificus venom only two SVSPs are described and gyroxin is considered the most studied SVSP which represents about 2,5% of the total venom. In the present study was reported the cloning of seven serine proteases amplified from a cDNA library of a venomous gland of a single adult specimen from Crotalus durissus terrificus venom. These clones have been analyzed in relation to the cDNA organization, structure and probable functions. The three-dimensional model of the gyroxin made possible the analysis of similarities with trypsin, thrombin and other SVSPs. The glycosylation and many disulfide bonds of the SVSPs make difficult the expression in E.coli to obtain the soluble recombinant toxin with activity. The expression in mammalian cells is very promising, because it is possible to make pos translation modification and to obtain the recombinant toxin secreted to the culture medium. The IgK signal peptide, the mature sequence and 3\'UTR region of gyroxin were cloned in the pED expression vector resulting in a new vector (pED-Giro). This vector carries the Igk signal peptide, which allows the secretion of the protein to the culture medium. The pED-Giro vector was transfected in CHO DXB11 dhfr and COS-7 cells. The gyroxin was detected in COS-7 total extract by western blot and after, purified from the medium culture and its integrity was confirmed by esterase activity assay.

As serino proteases participam de diversos processos fisiológicos (tal como o de coagulação) e patológicos. Essas enzimas estão amplamente distribuídas entre as espécies, são também toxinas dos venenos de serpentes, sendo denominadas SVSPs (snake venom serine proteases). Essas SVSPs são multifuncionais e contêm uma tríade catalítica formada pelos aminoácidos HDS. Algumas SVSPs são comercialmente disponíveis, sendo indicadas para o tratamento de infarto do miocárdio, tromboses e embolia pulmonar. No veneno de Crotalus durissus terrificus estão descritas até o momento, apenas duas SVSPs sendo que a mais estudada é a giroxina que representa cerca de 2,5% do veneno total. No presente estudo foi reportado a clonagem de sete serino proteases amplificadas a partir de uma biblioteca de cDNA de glândula de veneno de um único espécime adulto de Crotalus durissus terrificus. Estes clones foram analisados com relação à organização do cDNA, estrutura e prováveis funções. A construção do modelo tridimensional da giroxina permitiu verificar as similaridades com tripsina, trombina e outras SVSPs. A glicosilação e a presença de muitas pontes dissulfetos dificultam a obtenção das SVSP recombinantes na forma solúvel e com atividade, por expressão em E.coli. Assim, neste trabalho foi abordada a expressão em células de mamífero (que realiza as modificações pós-traducionais) com resultados promissores. Para tanto, o peptídeo sinal de Igk, a seqüência madura e a região 3 UTR da giroxina foram clonados no vetor pED, originando um novo vetor (pED-Giro). Este vetor carrega o peptídeo sinal de Igk, o que possibilitou a secreção da giroxina para o meio de cultura. O vetor pED-Giro foi transfectado em células CHO DXB11 dhfr e COS-7. A giroxina foi detectada no extrato total das células COS-7 por western blot e, em seguida, purificada do meio de cultura com coluna de afinidade (Benzamidina Sepharose) e demonstrado sua integridade pelo ensaio de atividade esterásica. / The serine proteases affect several physiological processes (such as the coagulation cascade) and pathological ones. These enzymes are widely distributed beyond the species; they are also toxins from snake venoms and are called SVSPs (snake venom serine proteases). These SVSPs are multifunctional and have a catalytic triad formed by HDS amino acids. Some of them are commercially available for use in clinical treatment for heart attack, tromboses and pulmonary embolism. So far, in Crotalus durissus terrificus venom only two SVSPs are described and gyroxin is considered the most studied SVSP which represents about 2,5% of the total venom. In the present study was reported the cloning of seven serine proteases amplified from a cDNA library of a venomous gland of a single adult specimen from Crotalus durissus terrificus venom. These clones have been analyzed in relation to the cDNA organization, structure and probable functions. The three-dimensional model of the gyroxin made possible the analysis of similarities with trypsin, thrombin and other SVSPs. The glycosylation and many disulfide bonds of the SVSPs make difficult the expression in E.coli to obtain the soluble recombinant toxin with activity. The expression in mammalian cells is very promising, because it is possible to make pos translation modification and to obtain the recombinant toxin secreted to the culture medium. The IgK signal peptide, the mature sequence and 3\'UTR region of gyroxin were cloned in the pED expression vector resulting in a new vector (pED-Giro). This vector carries the Igk signal peptide, which allows the secretion of the protein to the culture medium. The pED-Giro vector was transfected in CHO DXB11 dhfr and COS-7 cells. The gyroxin was detected in COS-7 total extract by western blot and after, purified from the medium culture and its integrity was confirmed by esterase activity assay.