The DNA origami method was established by Paul Rothemund in 2009.
It allows to produce self-assembling 2D nanostructures with precise geometry and tunable mechanical properties that can be equipped with a broad range of functionalizations.
It was extended to 3D by the group of William Shih in 2009 which also presented caDNAno, a software that made the design of nanostructures easier and more accessible.
Since then, DNA origami nanostructures were utilized in a broad range of applications, which enabled unprecedented insight into mechanisms and processes of biological systems at the nanoscale.
In this thesis multiple nanostructures were designed and manufactured to perform studies at the single-molecule level, which yielded a number of scientifically relevant contributions in the fields of biophysics and nanotechnology.
Development of DNA origami nanostructures to mimic the properties and function of membrane proteins
As a first application, DNA origami nanostructures with defined geometric and mechanical properties were designed, that mimic the behaviour and function of membrane proteins.
To this end, rod-shaped nanostructures were equipped with precisely placed, lipid-integrating cholesterol modifications as well as fluorescent dyes.
Subsequently their interaction with lipid membranes was studied.
It was found that the prepared nanostructures specifically bound to lipid membranes and could diffuse on their surface, for which the rotational and translational diffusion coefficients were determined.
The presence of magnesium thereby promoted the nanostructures to migrate into specific lipid domains in a reversible, switchable manner.
Furthermore, their high aspect ratio allowed to investigate crowding effects, which are considered important mechanisms for the self-organisation of membrane proteins.
In addition, block-shaped DNA origami nanostructures that organized into micrometre-sized super-structures were designed and produced.
They were capable of deforming lipid membranes on the scale of micrometres in a similar fashion to biological counterparts.
Establishing ultra-fast twist and torque measurements using DNA origami nanorotors
In an additional application, DNA origami nanorotors were developed to perform ultra-fast single-molecule twist and torque measurements, allowing to resolve subtle changes in real-time.
This also required the development of a new measurement setup that extended magnetic tweezers with the capability to detect the scattered light of gold nanoparticles.
Hence, a complex setup was constructed and calibrated that enabled magnetic tweezers measurements with up to 4 kHz and simultaneously track gold nanoparticles at 4 kHz as well.
In an alternative configuration the setup allowed simultaneous magnetic tweezers and single-molecule fluorescence and FRET measurements.
DNA origami nanorotors which were embedded within DNA constructs and carried the gold nanoparticles were then obtained and used to perform ultra-fast twist and torque measurements.
This constituted improvements in the spatio-temporal resolution over previous methods by one to three orders of magnitude, as demonstrated by direct measurements on the torsional response of DNA to external twists and the unwinding of DNA by an enzyme.
Direct measurements of the energy landscape and dynamics of the R-loop formation by the CRISPR-Cas surveillance complex Cascade
Using the DNA origami nanorotor enhanced ultra-fast twist measurements, the target recognition process of the CRISPR-Cas surveillance complex Cascade was directly observed.
Effector complexes of CRISPR-Cas systems have been widely applied in genome editing recently, since they can be programmed to bind practically any genomic target by their intrinsic RNA (crRNA) component.
They have, however, considerable tolerance for mismatches between their RNA and their intended DNA target.
For Cascade, after binding with a protein motif to a DNA target, base-pairing between crRNA and the double-stranded DNA target is initiated, resulting in the formation of an R-loop structure which leads to unwinding of the DNA.
This was directly measured using the nanorotor, which provided unprecedented insight in the R-loop formation by Cascade, allowing to determine the underlying energy landscape and the dynamics of the process.
It was shown that R-loop progression occurs on 6-bp kinetic intermediate steps with an underlying single base pair stepping on fast time scales.
Furthermore the effect of mutations in the target DNA on the R-loop formation process was investigated, indicating that the global shape of the energy landscape allows for a highly specific kinetic discrimination of mismatched targets.
Investigations into the locking transition, a conformational change that occurs after the full formation of the R-loop and is a prerequisite for subsequent DNA degradation, completed the study.
Overall, the findings provide a better understanding of the target recognition process of Cascade, which will contribute to the construction of more precise gene-editing tools in the future.
Furthermore, the nanorotor-assisted measurements are applicable to many twist and torque inducing mechanisms and processes that can be investigated in further studies.:1. Introduction
2. Multifunctional magnetic tweezers
3. Applications of DNA origami
4. Ultra-Fast torque measurements on supercoiled DNA
5. R-loop dynamics of the CRISPR-Cas Cascade complex
6. Summary and Discussion
Bibliography
List of Figures
List of Tables
List of Publications
A. Appendix / Die DNA Origami Methode wurde im Jahr 2006 durch Paul Rothemund begründet.
Sie erlaubt es selbst-assemblierende 2D Nanostrukturen mit präzisen Geometrien und kalibrierbaren mechanischen Eigenschaften zu erstellen, die zudem mit einer Vielzahl an Funktionalisierungen ausgestattet werden können.
Die Methode wurde 2009 in der Gruppe von William Shih auf 3D Nanostrukturen erweitert, wobei zudem caDNAno präsentiert wurde, eine Software die die Erstellung solcher Nanostrukturen wesentlich einfacher und zugänglicher machte.
Seitdem wurden DNA Origami Nanostrukturen in vielfältigen Anwendungen genutzt, die nie dagewesene Einblicke in Mechanismen und Prozesse von biologischen Systemen auf der Nanoskala erlaubten.
In dieser Arbeit wird anhand mehrerer Beispiele gezeigt, wie solche Nanostrukturen genutzt werden können, um Studien auf der Einzelmolekül-Ebene durchzuführen.
Entwicklung von DNA Origami Nanostrukturen, welche die Eigenschaften und Funktionen von Membranproteinen imitieren
In einer ersten Anwendung wurden DNA Origami Nanostrukturen mit definierten geometrischen und mechanischen Eigenschaften entworfen, welche das Verhalten und die Funktion von Membranproteinen nachahmten.
Dazu wurden stabförmige Nanostrukturen mit präzise platzierten,
lipidintegrierenden Cholesterinmodifikationen und fluoreszierenden Farbstoffen ausgestattet.
Anschließend wurde ihre Interaktion mit Lipidmembranen untersucht.
Es zeigte sich, dass die Nanostrukturen spezifisch an Lipidmembranen binden und auf deren Oberfläche diffundieren konnten.
Hierbei wurden die Diffusionskoeffizienten der Rotations- und Translationsbewegungen bestimmt.
Zudem bewirkte die An- oder Abwesenheit freier Magnesiumionen die steuerbare und reversible Anreicherung in verschiedenen Lipiddomänen.
Die längliche Form der Nanostrukturen erlaubte es zudem, Verdrängungseffekte zu untersuchen, die als wichtiger Mechanismus für die Selbstorganisation von Membranproteinen gelten.
Des weiteren wurden blockartige, multimerisierende DNA Origami Nanostrukturen entwickelt, die mikrometer-große Superstrukturen bilden konnten.
Im ähnlichen Maße wie biologische Vorbilder, waren diese Strukturen in der Lage, Lipidmembranen über mehrere Mikrometer hinweg zu verformen.
Etablierung ultraschneller Verdrehungs- und Torsionsmessungen mit DNA Origami Nanorotoren
In einer weiteren Anwendung wurden DNA Origami Nanorotoren entwickelt, um ultraschnelle Einzelmolekül-Verdrehungs- und Torsionsmessungen durchzuführen, bei denen kleinste Veränderungen in Echtzeit beobachtet werden konnten.
Dazu wurde eine neue Messapparatur entwickelt, bei der eine Magnetische Pinzette um die Fähigkeit Goldnanopartikeln zu detektieren erweitert wurde.
Dies erlaubte die Konstruktion und Kalibrierung eines komplexen Messaufbaus, mit dem es möglich war Magnetische-Pinzetten-Messungen mit 4 kHz durchzuführen und gleichzeitig Goldnanopartikel mit ebenfalls 4 kHz zu verfolgen.
Zudem konnten in einer alternativen Konfiguration Magnetische-Pinzetten-Messungen mit Einzelmolekül-Fluoreszenz- und FRET-Messungen kombiniert werden.
Mit Goldnanopartikeln funktionalisierte DNA-Origami-Nanorotoren wurden anschließend in DNA-Konstrukte eingebettet und mit Hilfe des Messaufbaus für ultraschnelle Verdrehungs- und Torsionsmessungen genutzt.
Gegenüber vorheriger Methoden wurde dadurch die räumlich-zeitliche Auflösung um eine bis drei Größenordnungen verbessert.
Dies wurde anhand der Bestimmung der Torsionsreaktion von DNA auf Verdrehungen sowie deren Entwindung durch ein Enzym demonstriert.
Direkte Bestimmung der Energielandschaft und Dynamiken der R-loop Entstehung des CRISPR-Cas Überwachungskomplexes Cascade
Die entwickelten DNA Origami Nanorotoren ermöglichten zudem ultraschnelle Verdrehungsmessungen durchzuführen, um den Zielerkennungsprozess des CRISPR-Cas Überwachungskomplexes Cascade direkt zu beobachten.
Effektorkomplexe von CRISPR-Cas Systemen werden zunehmend als Geneditierwerkzeuge eingesetzt, da sie aufgrund ihrer intrinsischen RNA-Komponente (crRNA) darauf programmiert werden können an praktisch jede DNA-Sequenz zu binden.
Allerdings zeigen Sie eine beträchtliche Toleranz gegenüber Abweichungen zwischen der Sequenz ihrer RNA und der bestimmungsgemäßen DNA-Zielsequenz.
Grundsätzlich bindet Cascade zunächst mit einem Protein-Motiv an eine kurze DNA-Sequenz, woraufhin es zur Basenpaarung zwischen der crRNA und der doppelsträngigen DNA-Zielsequenz kommt.
Dabei entsteht ein R-loop, was zur Entwindung der DNA führt.
Dies wurde direkt mit Hilfe der Nanorotoren gemessen, was nie dagewesene Einblicke in diesen Prozess erlaubte und die Bestimmung der zugrundeliegenden Energielandschaft und Dynamiken ermöglichte.
Es wurde gezeigt, dass Längenänderungen des R-loops in kinetischen Zwischenschritten von 6 Basenpaaren erfolgen, denen Einzel-Basenpaar-Schritte auf schnelleren Zeitskalen zugrunde liegen.
Des weiteren wurde der Effekt von Mutationen der DNA-Zielsequenz auf die R-loop Entstehung untersucht.
Hierbei zeigte sich, dass die globale Form der Energielandschaft eine hochspezifische kinetische Differenzierung von inkongruenten Zielsequenzen erlaubt.
Untersuchungen des 'locking' Mechanismus, ein struktureller Übergang der nach der vollständigen Ausbildung des R-loops erfolgt und eine Voraussetzung für die nachfolgende Zersetzung von DNA darstellt, rundeten die Untersuchungen ab.
Insgesamt wurde gezeigt, dass mit Hilfe der ultraschnellen Verdrehungsmessungen, neue, detaillierte Einblicke in den Zielerkennungsprozess von Cascade gewonnen wurden, die zur Erstellung präziserer Genmanipulationswerkzeuge in der Zukunft beitragen können.
Darüber hinaus eignen sich die Nanorotoren zur Untersuchung weiterer verdrehungs- und torsionserzeugender Mechanismen und Prozesse, die in weiteren Studien erforscht werden können.:1. Introduction
2. Multifunctional magnetic tweezers
3. Applications of DNA origami
4. Ultra-Fast torque measurements on supercoiled DNA
5. R-loop dynamics of the CRISPR-Cas Cascade complex
6. Summary and Discussion
Bibliography
List of Figures
List of Tables
List of Publications
A. Appendix
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:90529 |
| Date | 15 March 2024 |
| Creators | Kauert, Dominik |
| Contributors | Seidel, Ralf, Lipfert, Jan, Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/acceptedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | urn:nbn:de:bsz:15-qucosa2-905287, qucosa:90528, qucosa:90528 |
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