In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, daß der physiologische Östrogenmetabolit 2-Methoxyestradiol (2-ME) eine sehr starke Wachstumshemmung auf Tumorzellen verschiedener solider Tumoren ausübt. Die untersuchten Tumoren sind das hepatozelluläre Karzinom (HCC), das Pankreaskarzinom und das Bronchialkarzinom. Alle drei Tumoren haben eine sehr schlechte Prognose, die sich in den letzten 20 Jahren trotz neuer OP-Techniken und neuer zytostatisch wirkender Substanzen sowie molekularer Therapieansätze nicht wesentlich verbessert hat. Beim HCC und beim Pankreaskarzinom konnten wir durch die Verwendung mehrerer Zelllinien eine Generalisierbarkeit der gefundenen Ergebnisse dokumentieren, denn es kam zu einer dosisabhängigen Wachstumshemmung von bis zu 90% bei allen bis auf eine Pankreaskarzinomzelllinie. Die Wirkung lies sich noch verstärken, indem wir 2-ME beim Pankreaskarzinom mit in der Klinik üblichen Zytostatika wie Gemcitabine, Docetaxel oder einem monoklonalen Antikörper gegen den EGF Rezeptor kombinierten. Wir fanden eine additive Wachstumshemmung in der Kombination mit allen verwendeten Substanzen. Beim Bronchialkarzinom basierten unsere Untersuchungen auf Vorarbeiten, bei denen bereits ein tumorhemmender Effekt durch 2-ME gefunden wurde. Wir kombinierten 2-ME mit Gentherapie. Dazu setzten wir ein Adenovirus, welches das Tumorsuppressorgen p53 exprimiert, ein. Hier konnten wir zeigen, daß das vom Gen des Adenovirus stammende p53 Protein nach systemischer intravenöser Applikation in den Lungenmetastasen exprimiert werden kann. 2-ME stabilisierte dieses p53 Protein, so daß eine ausreichende Menge funktionsfähigen p53 Proteins vorhanden war, um die Tumorzellen zu töten oder im Wachstum zu hemmen. Dies war der erste Bericht über eine erfolgreiche intravenöse Applikation eines adenoviralen Vektors mit einem Tumorsuppressorgen. 2-ME war nicht nur in der Lage, wachstumshemmend auf normale Tumorzellen zu wirken. Wir konnten auch zeigen, daß multiresistente Pankreaskarzinomzellen, die eine bis zu 1000-fach letale Dosis Zytostatika überleben, komplett sensibel gegenüber 2-ME waren. Die Wachstumshemmung durch 2-ME war in diesem Versuch identisch zwischen parentalen sensiblen Zellen und den multiresistenten Zellen. Die IC50 lag hier bei 0,56mM bzw bei 1,65mM je nachdem, ob das mdr-1 Gen exprimiert wurde oder nicht. Diese Werte entsprechen in etwa denen, die bei anderen Tumorzelltypen gefunden wurden. Auch Bronchialkarzinomzellen, die eine Resistenz gegen Cisplatin aufwiesen, zeigten sich ebenfalls komplett sensibel gegenüber 2-ME. Untersuchungen zur Toxizität von 2-ME zeigten, daß Kulturen von normalen humanen Hepatozyten, die von Leberresektaten gewonnen wurden, die Behandlung mit 2-ME überlebten. In parallelen Versuchen mit HCC Zellen zeigte sich eine signifikante Wachstumshemmung der Tumorzellen. Da die normalen Hepatozyten nicht proliferieren, untersuchten wir proliferierende Hepatozyten, indem wir Leberresektionen bei Mäusen durchführten. In der Leberregenerationssphase behandelten wir die Mäuse mit 2-ME. 2-ME hatte keine nachteilige Wirkung auf die Tiere. Nach Beendigung des Versuches waren die resezierten Lebern fast komplett regeneriert. Immunhistochemische Untersuchungen konnten zeigen, daß die Anzahl der apoptotischen Zellen in der regenerierenden Leber in der mit 2-ME behandelten Gruppe nicht zunahm. Durch eine Färbung mit PCNA konnte die Proliferation der Hepatozyten nach Resektion und damit die Regeneration verdeutlicht werden. Hier war die Proliferationsrate unabhängig von der Behandlung mit 2-ME. Als wesentlichen Mechanismus der Wachstumshemmung von Tumorzellen durch 2-ME fanden wir die starke Induktion von Apoptose in allen Zellen, bis auf die relativ resistente Pankreaskarzinomzelllinie PaTu 8988s. Mit mehreren Untersuchungstechniken konnten wir die Apoptose nachweisen. Um die Mechanismen der Apoptoseinduktion zu untersuchen, führten wir Western Blot Untersuchungen durch, die Veränderungen des Expressionsmusters apoptosebezogener Proteine aufzeigen sollten. Wir fanden eine Induktion des p53 Proteins in den HCC Zelllinien, die den Wild-Typ p53 exprimieren. Die Pankreaskarzinomzellen waren alle mutiert für das p53 Gen, so daß hier nach 2-ME Behandlung p53 unabhängige Apoptose vorlag. Messungen des p21 Proteins, einem direkten Effektor von p53, zeigte, daß es parallel zu p53 hochreguliert wurde, was darauf schließen läßt, daß das hochregulierte p53 funktionell aktiv ist. In einer Zelllinie (SK-Hep 1) wurde das stärkste Antiapoptoseprotein bcl-2 herunterreguliert, was eine Förderung der Apoptoseinduktion nach sich zieht. Somit führen mehrere Mechanismen zum apoptotischen Zelltod. Tierversuche an Nacktmäusen zeigten nicht nur, daß 2-ME Tumorzellen töten kann, sondern lassen auch Rückschlüsse für eine klinische Anwendung zu. So konnten wir zeigen, daß subcutane HCC Tumoren zu 55% und Lungenmetastasen von Pankreaskarzinomen und Bronchialkarzinomen um 59, bzw. 55% im Wachstum gehemmt werden konnten. Die Kombination mit dem p53 tragenden Adenovirus verringerte die Tumormasse um weitere 14%. Die gesamte Tumormasse konnte durch diese Kombination um das 336-fache gegenüber der Kontrollgruppe reduziert werden. Den beschriebenen antiangiogenetischen Effekt konnten wir weder beim Pankreaskarzinom, noch beim Bronchialkarzinom nachvollziehen. Die Tiere zeigten keinerlei klinisch apparente Nebenwirkungen wie Durchfall, Gewichtsverlust, Bewegungsarmut oder anderes. Die Kontrollgruppe der Tiere mit Lungenmetastasen vom Pankreaskarzinom hingegen zeigte eine deutliche Tumorkachexie mit 20%igem Gewichtsverlust im Vergleich zur Therapiegruppe. Schlußfolgernd ist 2-ME eine Substanz, die von großem klinischen Interesse ist. Durch die hohe Wirksamkeit in vitro und in vivo bei gleichzeitig sehr geringen Nebenwirkungen wird sie derzeit in der Klinik in Phase I/II Studien getestet. Die orale Gabe macht die Durchführung der Therapie ambulant möglich. Kombinationen mit wirksamen zytostatischen Substanzen scheinen die Wirksamkeit bei Gleichbleiben der Nebenwirkungen noch zu verstärken. Besonders interessant scheint die Therapie bei multiresistenten Tumoren, wie sie beim Tumorrezidiv meist vorliegen. / We here show that the physiological estrogen metabolite 2-Methoxyestradiol (2-ME) has a very strong growth inhibitory effect on cell lines from different solid cancer types. The tumors investigated were hepatocellular carcinome (HCC), pancreatic cancer, and lung cancer. All three tumor types present with a very poor prognosis, which did not improve significantly the last 20 years in spite of new operation techniques, new anticancer drugs, or new molecular approaches. Using several different cell lines of each cancer type we studied, we could confirm a generalized phenomenon of cancer growth inhibition by 2-ME. We found up to 90% growth inhibition in all cell lines with the exception of one pancreatic cancer cell line. This effect could even be increased using combination therapies of 2-ME and Gemcitabine, 5-FU, Taxol or a monoclonal antibody against the EGF receptor. We found an additive growth inhibition when all of these anticancer agents were combined with 2-ME. Our studies on lung cancer were based on previous results, where 2-ME stabilized the p53 protein. We combined 2-ME with gene therapy and used a wild-type p53 expressing adenovirus, which was administered intraveneously. 2-ME was given orally. The p53 gene was expressed in lung colonies. 2-ME stabilized the p53 protein in a quantity that there was enough p53 protein to be able to kill the cancer cells and to inhibit the cancer growth. This was the first report showing that an adenoviral gene transfer using a tumor suppressor gene can have an effect after intraveneous application. We also showed that 2-ME was able to inhibit the growth of multi-resistant pancreatic cancer cells, which were resistant to up to 1000 fold against different anticancer agents. The degree of growth inhibition after 2-ME treatment was identical between normal cancer cells and multi-resistant cancer cells. The IC50 was 0.56µM in mdr-1 gene expressing cells and 1.65µM in mdr-1 gene negative cells. These values are very similar to those seen in normal cancer cells. Lung cancer cells resistant against cisplatin also showed to be sensitive to 2-ME. Toxicitiy studies showed that cultured normal hepatocytes harvested from resected livers survived the treatment with 2-ME. Parallel studies with cancer cells showed strong growth inhibition at the same doses. Since normal hepatocytes do not proliferate in culture, we studied proliferating hepatocytes in vivo after liver resection in mice. After resection, the livers recieve a strong proliferation stimulus, which causes hepatocyte proliferation. During the regeneration, we treated the mice with 2-ME. We found no induction of apoptosis after 2-ME treatment in proliferating hepatocytes. Liver regeneration was not inhibited by 2-ME as shown by immunohistochemistry using PCNA. The major mechanism of growth inhibition due to 2-ME treatment was the induction of apoptosis in all cell lines except one pancreatic cancer cell line (PaTu 8988s). We confirmed the induction of apoptosis with several different methods. To study further mechanisms of induction of apoptosis, we performed western blot analysis for apoptosis related proteins. We found a p53 over-expression in all HCC cells expressing wild-type p53. The pancreatic cancer cells were all mutant for the p53 gene, which suggests the presence of p53 independent mechanisms of apoptosis. The tumor suppressor protein p21, a direct effector protein of p53, was also up-regulated when p53 was up-regulated, which shows that the up-regulated p53 protein is active. In one HCC cell line (SK-Hep1), which is the most sensitive to 2-ME, we found a down-regulation of the strongest anti-apoptosis protein, bcl-2. This effect causes an induction of apoptosis. Thus, different mechanisms lead to an increased induction of apoptosis. Animal experiments on nude mice show significant growth inhibition of different tumors. HCC tumors were implanted subcutaneously and were inhibited by 55%, lung metastases from lung and pancreatic cancer cells were inhibited by 55% and 59%, respectively. The combination of 2-ME and the p53 expressing adenovirus could further inhibit tumor growth by 14%. The total tumor burden could be reduced by 336 fold in this combination therapy compared to the non treated control group. The described antiangiogenetic effect in the literature could not be confirmed in our experiments on pancreatic and lung cancer. The animals did not show any sign of side effects after treatment with 2-ME such as diarrhea, weight loss, hypocinesia, or others. The animals of the control groups with lung metastases from lung or pancreatic cancer showed cachexy due to tumor burden with an average weight loss of 20% compared to the treated animals. In conclusion, 2-ME is a compound of high clinical interest. The strong efficacy in vitro and in vivo on growth inhibition of tumors with no or slight side effects led to the initiation of clinical phase I and II trials. The oral administration allows an outpatient treatment. The combination with other clinically used anti-cancer drugs appears to increase the effect on tumor growth while the side effects don''t increase. Of particular interest will be the treatment of multi-resistant cancers, for example in the case of recurrent cancer.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/14592 |
| Date | 14 April 2004 |
| Creators | Schumacher, Guido |
| Contributors | Hölscher, A.H., Bruch, H.P. |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin, Medizinische Fakultät - Universitätsklinikum Charité |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf, application/octet-stream, application/octet-stream |
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