Título de Ingeniería en Biotecnología Molecular / Los mecanismos involucrados en el control post-transcripcional del ciclo
replicativo del Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH), específicamente los
eventos moleculares que permiten la interacción del ARN genómico (ARNg) viral
con la maquinaria celular para su transporte, traducción o empaque dentro de la
célula, aún no han sido completamente dilucidados. Actualmente existen diversas
técnicas para el estudio de la localización sub-celular de ARNg, entre las que
destaca RNA FISH (RNA Fluorescent in situ hybridization), método ampliamente
utilizado para el estudio de la localización y cambios temporales de ARN y
ribonucleoproteínas. Generalmente, en esta técnica se utilizan sondas acopladas
a fluoróforos orgánicos que hibridan a regiones específicas para las que han sido
diseñadas. No obstante, estas sondas presentan fotoblanqueamiento
significativo, y un espectro de emisión amplio (50-100 nm), lo que limita su uso.
Es por esto que surge la necesidad de recurrir a nuevas alternativas, tales como
sondas acopladas a Quantum dots (QDs), los cuales en contraste con fluoróforos
orgánicos poseen una vida fluorescente significativamente más larga, mayor
fotoestabilidad y un amplio espectro de absorción. Considerando lo anterior, en
el presente trabajo se propone la construcción de sondas específicas asociadas
a QDs compuestos de Cadmio-Telurio recubiertos por Glutatión (QDs CdTe-
GSH) que reconocen la región pBSK-GagPol como matriz para la transcripción
in vitro, obteniendo así fragmentos de ARN, los cuales fueron desfosforilados en
su extremo 5', para luego incorporarles en su lugar un fosfato γ unido a un grupo
sulfhidrilo (SH). De esta forma, los transcritos de ARN fueron capaces de unirse
a QDs CdTe-GSH a través de enlaces disulfuro. Generando así sondas de ARN
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acoplada a QDs CdTe-GSH capaces de unirse al ARNg de VIH-1 en presencia
y ausencia de la proteína Rev,la cual actúa como un regulador clave en el control
post-transcripcional de la expresión génica viral, actuando principalmente en los
procesos de exportación nuclear y traducción. De manera que en estas
condiciones fue posible validar a través de experimentos de RNA FISH, el ingreso
citoplasmático y nuclear de la sonda de ARN acoplada a QDs CdTe-GSH,
además de una interacción específica con el ARN genómico de VIH-1. Este
hecho representa la prueba de concepto de que es posible generar una sonda
acoplada a QDs específica contra el ARN genómico de VIH-1, permitiendo el
estudio de la expresión génica del virus, lo que también abre nuevas posibilidades
para el estudio de VIH-2 u otros tipos de virus. / The mechanisms involved in the post-transcriptional control of the replicative
cycle of the Human Immudeficiency Virus (HIV), specifically the molecular events
allowing the interaction between the viral genomic RNA (gRNA) and the cellular
machinery for the transport, translation or packaging, have not been elucidated
yet. Currently, the study of localization and temporary changes of RNA and
ribonucleoproteins relies mainly on RNA FISH (RNA Fluorescent in situ
hybridization)-based strategies. RNA FISH uses specific hybridization probes
coupled to organic fluorophores. However, these fluorescent molecules
commonly present limiting characteristics such as significant photobleaching and
a wide emission spectrum (50-100 nm). Therefore, a considerable demand arises
for new alternatives, such as probed coupled to Quantum dots (QDs), which in
contrast to organic fluorophores, exhibit longer fluorescence lifetime, higher
photostability and broad absorption spectra. Considering previous facts, the aim
of this work was to develop specific probes coupled to glutathione-capped
cadmium-telluride quantum dots (QDs CdTe-GSH), able of recognizing and
associate with the Gag-Pol region present on the HIV-1 genomic RNA (gRNA).
Thus, in order to achieve this objective, the vector pBSK-GagPol was used as a
template for in vitro transcription of Gag-Pol complementary RNA, which was
fragmented and dephosphorylated at the 5' end, with the purpose to incorporate
a γ phosphate coupled to a sulfhydryl group (SH) instead. Then, the SH-containing
RNA fragments were attached to QDs CdTe-GSH by a disulfide bond. As a result,
we generated single-stranded RNA probes coupled to QDs CdTe-GSH capable
of hybridizing to HIV-1 gRNA in the presence and absence of the viral protein Rev,
which acts as a key regulator of the post-transcriptional control of viral gene
expression acting mainly during nuclear export and translation. Thereby, under
these conditions, we validated the cytoplasmic and nuclear entrance of the probe
coupled to Qds CdTe-GSH, and specific interaction between the probe and gRNA
of HIV-1. This fact represents the proof of concept that it is possible to generate
RNA probes coupled to QDs CdTe-GSH to study genetic expression of HIV-1,
and also opens up new opportunities for the study of HIV-2 or other virus types.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/148975 |
| Date | January 2018 |
| Creators | Leyva Gutiérrez, Alejandra. |
| Contributors | Soto Rifo, Ricardo., Toro Ascuy, Daniela, Stange Klein, Claudia, Universidad de Chile. Facultad de Ciencias. Escuela de Pregrado. |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Chile, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/ |
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