Titre de l'écran-titre (visionné le 29 juin 2023) / Les techniques d'édition du génome telles que CRISPR-Cas9, permettant l'introduction ciblée de modifications génétiques, offrent de nombreuses possibilités de développement d'outils de recherche ainsi que d'applications thérapeutiques. Dans le cadre de mes travaux effectués en co-direction à Héma-Québec, je me suis intéressée au potentiel de CRISPR-Cas9 en lien avec le système hématopoïétique et plus particulièrement en lien avec les globules rouges. Premièrement, j'ai exploré dans le chapitre 1 la modification spécifique de groupe sanguins qui est d'intérêt pour augmenter les possibilités transfusionnelles. Des globules rouges (GRs) de groupe sanguin rare Rhnull ont été créés en supprimant le gène RHAG des cellules souches hématopoïétiques (CSH) avec CRISPR-Cas9, suivi d'une différentiation érythrocytaire in vitro. Ce groupe sanguin pourrait théoriquement être utilisé pour transfuser des individus ayant n'importe quel variant Rh, en plus d'être utile en tant que réactif de sérologie. Le gène ABO a aussi été supprimé des CSH de groupe A, pour produire des GRs de groupe O. L'absence d'expression résiduelle des antigènes de type A obtenue à partir des CSH hétérozygotes A/O pourrait permettre de futures applications transfusionnelles comme des cas de donneur/receveur compatibles pour des phénotypes rares mais incompatibles pour le système ABO. Ensuite, un aspect prometteur du système CRISPR-Cas9 étant la correction thérapeutique de maladies génétiques, les greffes autologues de CSH génétiquement modifiées par cette technologie font l'objet de plus en plus d'études cliniques. Dans ce contexte, j'ai travaillé sur la modélisation in vitro de variants génétiques avec comme preuve de concept l'anémie falciforme puisque cela pourrait contribuer à l'étude des répercussions potentielles de l'édition du génome sur les CSH et les GRs, et complémenter les études cliniques. Une récapitulation complète de l'érythropoïèse in vitro jusqu'à la production de GRs matures a été considérée pertinente pour une caractérisation plus fidèle à la réalité de phénotypes érythrocytaires, pour étudier l'impact de divers variants sur les GRs, en plus d'être avantageuse dans l'optique de futures transfusions. La production de GRs in vitro est un objectif important en médecine transfusionnelle depuis plusieurs années et il est possible de reproduire l'érythropoïèse in vitro à partir de plusieurs sources cellulaires, dont les CSH. Cependant, les protocoles publiés à ce jour mettent peu l'accent sur l'étape de maturation finale des réticulocytes en GRs matures, analogues à ceux retrouvés en circulation, ou requièrent l'utilisation de cellules accessoires ou nourricières. Or, l'utilisation de cellules accessoires ou nourricières pourrait restreindre de potentielles applications pertinentes du modèle comme les transfusions et l'édition génétique ex vivo. Dans un premier temps, j'ai développé dans le chapitre 2 un protocole de culture cellulaire permettant une maturation accrue des réticulocytes en GRs in vitro ainsi qu'une maximisation de leur survie en culture durant cette étape, dans un milieu ne contenant aucun composé animal, cellules accessoires ou cellules nourricières. Les GRs obtenus ont un phénotype similaire à celui des GRs produits par le corps humain et ils peuvent être conservés en solution nutritive pendant 42 jours comme pour les GRs récoltés de dons de sang. Dans un second temps, j'ai optimisé dans le chapitre 3 un protocole d'édition avec CRISPR-Cas9 compatible avec la clinique, sans vecteur viral et sans sélection, dans le but d'être combiné à la production de GRs. L'introduction à une fréquence élevée de la mutation causant l'anémie falciforme, notamment de manière bi-allélique, dans des CSH suivie de la différenciation complète en GRs a permis de générer des GRs adoptant la forme caractéristique en faucille après exposition à des niveaux d'oxygène physiologiques, récapitulant ainsi l'anémie falciforme in vitro. De plus, un sous-produit d'édition produisant un variant de globine beta qui semble exprimé à des niveaux significatifs dans les GRs est présent à la suite du ciblage de la mutation dans le gène de la globine beta. La présence de ce variant mérite attention dans l'optique du développement thérapeutique pour l'anémie falciforme. En conclusion, les procédures optimisées de culture de GRs et de modifications génétiques avec CRISPR-Cas9 présentées dans cette thèse peuvent être combinées de différentes façons afin de fournir une plateforme d'étude de variants érythrocytaires in vitro, en plus de contribuer aux efforts vers la transfusion de GRs produits in vitro et d'accompagner les thérapies d'édition génétique arrivant en clinique. / Genome editing techniques, such as CRISPR-Cas9, allowing the introduction of targeted genetic modifications, offer numerous research tool possibilities and potential cellular therapies. As part of my work done in co-direction at Héma-Québec, I became interested in the potential of CRISPR-Cas9 in relation to the hematopoietic system and more particularly in relation to red blood cells. First, I explored in chapter 1 specific blood type modifications that are of interest in increasing transfusion opportunities. Rhnull cultured red blood cells (cRBCs) were produced by deleting RHAG gene in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with CRISPR-Cas9, followed by in vitro erythroid differentiation. These red blood cells (RBCs) could theoretically be used to transfuse all Rh types, in addition to their relevance as RBC reagents for serology laboratories. ABO gene was also deleted in type A HSPCs to produce type O RBCs. The absence of residual A antigen expression when starting with heterozygotes A/O donors could allow future transfusion applications like cases of individuals compatible for rare phenotypes but frustratingly not for ABO. Then, a promising aspect of the CRISPR-Cas9 system being the therapeutic correction of genetic diseases, autologous hematopoietic stem cell (HSC) transplants genetically modified by this technology are the subject of more and more clinical studies. In this context, I worked on the in vitro modeling of genetic variants with sickle cell anemia (SCA) as proof of concept since it could contribute to the efforts aiming at studying and understanding potential side effects of genome editing on HSCs and RBCs, and complement clinical studies. The complete recapitulation of erythropoiesis in vitro, including terminal RBC maturation, was considered essential for the faithful characterization of erythroid phenotypes, for studying the impact of genetic variants on RBCs, in addition to being beneficial for future transfusion purposes. Production of cRBCs has been a major objective in the field of transfusion medicine for several years and erythropoiesis can be reproduced in vitro starting with several cell sources, one of which being HSPCs. However, current protocols do not focus on the process of reticulocyte maturation into RBCs, analogous to those found in the circulation, or they require accessory or feeder cells. Of note, accessory or feeder cells could restrict potentially relevant applications of the model like transfusions or ex vivo genome editing. First, I developed in chapter 2 a cell culture protocol allowing an increased maturation of reticulocytes into RBCs in vitro as well as a maximization of their survival in culture, using an animal component-free, accessory-free, and feeder-free medium. The resulting cRBCs had a similar phenotype as native RBCs and they could be stored for 42 days like RBCs collected from blood donations. Second, I optimized a virus-free and selection-free CRISPR-Cas9 strategy compatible with the clinic to use it in combination with cRBCs production. High efficiency introduction of the SCA-causing mutation, notably bi-allelic introduction, followed by mature cRBCs production yielded cells acquiring the characteristic sickled shape after exposition to physiological oxygen levels, thereby recapitulating SCA in vitro. Furthermore, an editing by-product giving rise to a beta globin variant seemingly expressed at significant levels in RBCs was present following the targeting of the mutation in the beta globin gene. The presence of this beta globin variant thus deserves further attention in the context of therapeutic development for SCA. To conclude, optimized procedures of RBCs' culture and CRISPR-Cas9-mediated genome editing presented in this thesis can be combined in several ways to provide a platform for the study of erythroid variants in vitro, in addition to contributing to the efforts towards future cRBCs transfusion and accompanying the coming gene editing therapies.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LAVAL/oai:corpus.ulaval.ca:20.500.11794/120123 |
| Date | 12 November 2023 |
| Creators | Boccacci, Yelena |
| Contributors | Doyon, Yannick, Laganière, Josée |
| Source Sets | Université Laval |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | COAR1_1::Texte::Thèse::Thèse de doctorat |
| Format | 1 ressource en ligne (xx, 187 pages), application/pdf |
| Rights | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
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