L'émergence de disciplines post-génomiques, telles que la protéomique et la métabolomique, requiert le développement d'outils analytiques toujours plus performants afin de déterminer, respectivement, l'ensemble des peptides et protéines et des composés organiques de faible masse moléculaire présents dans un milieu biologique. En raison de sa sensibilité, spécificité et rapidité d'acquisition des données, la désorption/ionisation laser assistée par une matrice (MALDI) constitue une des méthodes d'ionisation majeure en spectrométrie de masse (MS) permettant d'envisager les analyses de ces composés. Cependant, elle présente des limitations pour la détection de petites molécules (<700 Da) due à la présence des ions de matrice dans les basses masses du spectre. Dans ce contexte, le potentiel de différentes techniques LDI alternatives a été évalué dans le cadre de la détection de peptides synthétiques de compositions et de tailles variées. Dans le cadre de cette thèse, de nouvelles stratégies analytiques LDI-MS et LDI-MS/MS basées sur l'utilisation de matrices inertes ont été développées. Pour ce faire, des substrats, à base de silice et de titane présentant différentes structurations, ont été utilisés pour assister la désorption/ionisation sans ajout de matrice organique. L'optimisation des méthodologies a été réalisée, puis l'évaluation de la sensibilité et de la reproductibilité des techniques a ensuite été appréciée. Les problématiques de discrimination spectrale dans le cas d'analyses de mélanges de peptides synthétiques et ou issus de digestats trypsiques de protéines ont été abordées afin de valider ces méthodologies LDI pour des applications en protéomique. Les performances des méthodes ont été comparées à celles obtenues dans des stratégies LDI assistées par des matrices organiques (MALDI) pour des échantillons de peptides synthétiques seuls et en mélange ainsi que de quatre digestats trypsiques issus du Cytochrome C (12 kDa), de la β-Caséine (24 kDa), de l'albumine de sérum bovin (BSA, 66 kDa) et du fibrinogène (340 kDa). Un second aspect a consisté en l'analyse de peptide en spectrométrie de masse en tandem. Pour cela, des expériences de dissociation de peptides en fragmentation basse et haute énergie respectivement sur des appareillages de type ESI-QqTOF et MALDI-TOF/TOF ont été menées. Les résultats obtenus ont contribué à une meilleure compréhension du séquençage peptidique et ont démontré des comportements particuliers propres à certaines séquences observés quelles que soient les méthodes d'activation vibrationnelle employées. La présence de résidus basiques, à partir du moment où ils ne se trouvent pas en position C-terminale, a été déterminante pour déclencher des voies de fragmentation en compétition avec les dissociations bx-yn attendues. Ces comportements doivent être impérativement pris en compte par les logiciels de séquençage. / The advent of proteomics and metabolomics require the development of highly efficient analytical tool in order to detect and identify peptides and proteins as well as small organic compounds present in biological media. Due to its sensitivity, specificity and speed of data acquisition, Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization constitutes one of the major ionization methods in mass spectrometry suitable for the analyses of biomolecules. However the sensitive detection of low molecular weight compounds (<700 Da) is most of the time troublesome, being hampered by the production of matrix ions in the low mass range. In that case, the potency of various alternative LDI techniques based on inert ionization promoting substrates was evaluated for the detection of synthetic peptides presenting wide sequence diversity. Silicon and titanium based materials exhibiting different physico-chemical properties were probed for LDI-MS and LDI-MS/MS analyses of the designed model peptides. These methods, which were devoted of the use of any organic matrix, were optimized through a large set of experiments, taking particular attention to detection sensitivity and reproducibility. Spectral discrimination was another matter of concern, especially in the case of peptide mixture analyses which is encountered in proteomics for tryptic digest elucidation. The performances of the design LDI methods were compared with the original MALDI technique for peptide detection and sequencing from various samples i.e. pure and mixed synthetic peptides, and four tryptic digests issued from Cytochrome C (12 kDa), β-Casein (24 kDa), Bovin serum albumin (BSA, 66 kDa) and fibrinogen (340 kDa). A second research topic dealing with peptide sequencing by MS/MS technologies was pursued in order to contribute to the knowledge of the fragmentation rules. Vibrational activation methods through various mass analyzer configurations (MALDI-TOF/TOF, ESI-QqTOF) were investigated. Specific dissociation behaviors were extracted from the recorded MS/MS data sets. The presence of basic residues, provided that they are not located at the peptide C-terminal end, triggered specific backbone fragmentation in competition to the expected bx-yn pathway. This was found to be a critical issue to be considered by sequencing softwares.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2012MON20069 |
| Date | 23 November 2012 |
| Creators | Dupré, Mathieu |
| Contributors | Montpellier 2, Enjalbal, Christine |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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