The aim of this thesis is the development and benchmarking of
computational methods for the analysis of high-throughput data from
tiling arrays and next-generation sequencing. Tiling arrays have been
a mainstay of genome-wide transcriptomics, e.g., in the identification
of functional elements in the human genome. Due to limitations of
existing methods for the data analysis of this data, a novel
statistical approach is presented that identifies expressed segments
as significant differences from the background distribution and thus
avoids dataset-specific parameters. This method detects differentially
expressed segments in biological data with significantly lower false
discovery rates and equivalent sensitivities compared to commonly used
methods. In addition, it is also clearly superior in the recovery of
exon-intron structures. Moreover, the search for local accumulations
of expressed segments in tiling array data has led to the
identification of very large expressed regions that may constitute a
new class of macroRNAs.
This thesis proceeds with next-generation sequencing for which various
protocols have been devised to study genomic, transcriptomic, and
epigenomic features. One of the first crucial steps in most NGS data
analyses is the mapping of sequencing reads to a reference
genome. This work introduces algorithmic methods to solve the mapping
tasks for three major NGS protocols: DNA-seq, RNA-seq, and
MethylC-seq. All methods have been thoroughly benchmarked and
integrated into the segemehl mapping suite.
First, mapping of DNA-seq data is facilitated by the core mapping
algorithm of segemehl. Since the initial publication, it has been
continuously updated and expanded. Here, extensive and reproducible
benchmarks are presented that compare segemehl to state-of-the-art
read aligners on various data sets. The results indicate that it is
not only more sensitive in finding the optimal alignment with respect
to the unit edit distance but also very specific compared to most
commonly used alternative read mappers. These advantages are
observable for both real and simulated reads, are largely independent
of the read length and sequencing technology, but come at the cost of
higher running time and memory consumption.
Second, the split-read extension of segemehl, presented by Hoffmann,
enables the mapping of RNA-seq data, a computationally more difficult
form of the mapping task due to the occurrence of splicing. Here, the
novel tool lack is presented, which aims to recover missed RNA-seq
read alignments using de novo splice junction information. It
performs very well in benchmarks and may thus be a beneficial
extension to RNA-seq analysis pipelines.
Third, a novel method is introduced that facilitates the mapping of
bisulfite-treated sequencing data. This protocol is considered the
gold standard in genome-wide studies of DNA methylation, one of the
major epigenetic modifications in animals and plants. The treatment of
DNA with sodium bisulfite selectively converts unmethylated cytosines
to uracils, while methylated ones remain unchanged. The bisulfite
extension developed here performs seed searches on a collapsed
alphabet followed by bisulfite-sensitive dynamic programming
alignments. Thus, it is insensitive to bisulfite-related mismatches
and does not rely on post-processing, in contrast to other methods. In
comparison to state-of-the-art tools, this method achieves
significantly higher sensitivities and performs time-competitive in
mapping millions of sequencing reads to vertebrate
genomes. Remarkably, the increase in sensitivity does not come at the
cost of decreased specificity and thus may finally result in a better
performance in calling the methylation rate.
Lastly, the potential of mapping strategies for de novo genome
assemblies is demonstrated with the introduction of a new guided
assembly procedure. It incorporates mapping as major component and
uses the additional information (e.g., annotation) as guide. With this
method, the complete mitochondrial genome of Eulimnogammarus verrucosus has been
successfully assembled even though the sequencing library has been
heavily dominated by nuclear DNA.
In summary, this thesis introduces algorithmic methods that
significantly improve the analysis of tiling array, DNA-seq, RNA-seq,
and MethylC-seq data, and proposes standards for benchmarking NGS read
aligners. Moreover, it presents a new guided assembly procedure that
has been successfully applied in the de novo assembly of a
crustacean mitogenome. / Diese Arbeit befasst sich mit der Entwicklung und dem Benchmarken von
Verfahren zur Analyse von Daten aus Hochdurchsatz-Technologien, wie
Tiling Arrays oder Hochdurchsatz-Sequenzierung. Tiling Arrays bildeten
lange Zeit die Grundlage für die genomweite Untersuchung des
Transkriptoms und kamen beispielsweise bei der Identifizierung
funktioneller Elemente im menschlichen Genom zum Einsatz. In dieser
Arbeit wird ein neues statistisches Verfahren zur Auswertung von
Tiling Array-Daten vorgestellt. Darin werden Segmente als exprimiert
klassifiziert, wenn sich deren Signale signifikant von der
Hintergrundverteilung unterscheiden. Dadurch werden keine auf den
Datensatz abgestimmten Parameterwerte benötigt. Die hier
vorgestellte Methode erkennt differentiell exprimierte Segmente in
biologischen Daten bei gleicher Sensitivität mit geringerer
Falsch-Positiv-Rate im Vergleich zu den derzeit hauptsächlich
eingesetzten Verfahren. Zudem ist die Methode bei der Erkennung von
Exon-Intron Grenzen präziser. Die Suche nach Anhäufungen
exprimierter Segmente hat darüber hinaus zur Entdeckung von sehr
langen Regionen geführt, welche möglicherweise eine neue
Klasse von macroRNAs darstellen.
Nach dem Exkurs zu Tiling Arrays konzentriert sich diese Arbeit nun
auf die Hochdurchsatz-Sequenzierung, für die bereits verschiedene
Sequenzierungsprotokolle zur Untersuchungen des Genoms, Transkriptoms
und Epigenoms etabliert sind. Einer der ersten und entscheidenden
Schritte in der Analyse von Sequenzierungsdaten stellt in den meisten
Fällen das Mappen dar, bei dem kurze Sequenzen (Reads) auf ein
großes Referenzgenom aligniert werden. Die vorliegende Arbeit
stellt algorithmische Methoden vor, welche das Mapping-Problem für
drei wichtige Sequenzierungsprotokolle (DNA-Seq, RNA-Seq und
MethylC-Seq) lösen. Alle Methoden wurden ausführlichen
Benchmarks unterzogen und sind in der segemehl-Suite integriert.
Als Erstes wird hier der Kern-Algorithmus von segemehl vorgestellt,
welcher das Mappen von DNA-Sequenzierungsdaten ermöglicht. Seit
der ersten Veröffentlichung wurde dieser kontinuierlich optimiert
und erweitert. In dieser Arbeit werden umfangreiche und auf
Reproduzierbarkeit bedachte Benchmarks präsentiert, in denen
segemehl auf zahlreichen Datensätzen mit bekannten
Mapping-Programmen verglichen wird. Die Ergebnisse zeigen, dass
segemehl nicht nur sensitiver im Auffinden von optimalen Alignments
bezüglich der Editierdistanz sondern auch sehr spezifisch im
Vergleich zu anderen Methoden ist. Diese Vorteile sind in realen und
simulierten Daten unabhängig von der Sequenzierungstechnologie
oder der Länge der Reads erkennbar, gehen aber zu Lasten einer
längeren Laufzeit und eines höheren Speicherverbrauchs.
Als Zweites wird das Mappen von RNA-Sequenzierungsdaten untersucht,
welches bereits von der Split-Read-Erweiterung von segemehl
unterstützt wird. Aufgrund von Spleißen ist diese Form des
Mapping-Problems rechnerisch aufwendiger. In dieser Arbeit wird das
neue Programm lack vorgestellt, welches darauf abzielt, fehlende
Read-Alignments mit Hilfe von de novo Spleiß-Information zu
finden. Es erzielt hervorragende Ergebnisse und stellt somit eine
sinnvolle Ergänzung zu Analyse-Pipelines für
RNA-Sequenzierungsdaten dar.
Als Drittes wird eine neue Methode zum Mappen von Bisulfit-behandelte
Sequenzierungsdaten vorgestellt. Dieses Protokoll gilt als
Goldstandard in der genomweiten Untersuchung der DNA-Methylierung,
einer der wichtigsten epigenetischen Modifikationen in Tieren und
Pflanzen. Dabei wird die DNA vor der Sequenzierung mit Natriumbisulfit
behandelt, welches selektiv nicht methylierte Cytosine zu Uracilen
konvertiert, während Methylcytosine davon unberührt
bleiben. Die hier vorgestellte Bisulfit-Erweiterung führt die
Seed-Suche auf einem reduziertem Alphabet durch und verifiziert die
erhaltenen Treffer mit einem auf dynamischer Programmierung
basierenden Bisulfit-sensitiven Alignment-Algorithmus. Das verwendete
Verfahren ist somit unempfindlich gegenüber
Bisulfit-Konvertierungen und erfordert im Gegensatz zu anderen
Verfahren keine weitere Nachverarbeitung. Im Vergleich zu aktuell
eingesetzten Programmen ist die Methode sensitiver und benötigt
eine vergleichbare Laufzeit beim Mappen von Millionen von Reads auf
große Genome. Bemerkenswerterweise wird die erhöhte
Sensitivität bei gleichbleibend guter Spezifizität
erreicht. Dadurch könnte diese Methode somit auch bessere
Ergebnisse bei der präzisen Bestimmung der Methylierungsraten
erreichen.
Schließlich wird noch das Potential von Mapping-Strategien für
Assemblierungen mit der Einführung eines neuen,
Kristallisation-genanntes Verfahren zur unterstützten
Assemblierung aufgezeigt. Es enthält Mapping als Hauptbestandteil
und nutzt Zusatzinformation (z.B. Annotationen) als
Unterstützung. Dieses Verfahren ermöglichte die erfolgreiche
Assemblierung des kompletten mitochondrialen Genoms von Eulimnogammarus verrucosus trotz
einer vorwiegend aus nukleärer DNA bestehenden genomischen
Bibliothek.
Zusammenfassend stellt diese Arbeit algorithmische Methoden vor,
welche die Analysen von Tiling Array, DNA-Seq, RNA-Seq und MethylC-Seq
Daten signifikant verbessern. Es werden zudem Standards für den
Vergleich von Programmen zum Mappen von Daten der
Hochdurchsatz-Sequenzierung vorgeschlagen. Darüber hinaus wird ein
neues Verfahren zur unterstützten Genom-Assemblierung vorgestellt,
welches erfolgreich bei der de novo-Assemblierung eines
mitochondrialen Krustentier-Genoms eingesetzt wurde.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa.de:bsz:15-qucosa-161623 |
| Date | 23 March 2015 |
| Creators | Otto, Christian |
| Contributors | Universität Leipzig, Fakultät für Mathematik und Informatik, Prof. Dr. Peter F. Stadler, Prof. Dr. Burkard Morgenstern |
| Publisher | Universitätsbibliothek Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | English |
| Detected Language | German |
| Type | doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
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