A leishmaniose é uma doença negligenciada provocada por parasitas do gênero Leishmania, que ocorre em mais de 90 países no mundo, afetando milhões de pessoas. A doença é tratável, mas ainda não tem cura, e o arsenal terapêutico comumente utilizado é limitado, e consiste do uso de fármacos de alta toxicidade. Sendo assim, a busca por novas terapias tem sido encorajada e o uso de compostos ativos isolados de produtos naturais, como plantas, tem se mostrado eficaz. Para uso futuro destes princípios ativos no tratamento, faz-se necessário o entendimento do seu mecanismo de ação. As ciências \"ômicas\", mais especificamente a metabolômica, que é a análise comparativa dos metabólitos alterados em um sistema biológico após intervenção externa, tem sido bastante aplicada com este objetivo. A abordagem metabolômica é multidisciplinar e as análises são realizadas com auxílio de plataformas analíticas modernas, como as técnicas de separação acopladas a espectrometria de massas (MS). Para tratamento dos dados são utilizadas ferramentas estatísticas avançadas, e as substâncias alteradas são correlacionadas com rotas metabólicas. Neste trabalho, o mecanismo de ação em Leishmania infantum da substância ativa (metildihidrodieugenol B) isolada da planta Nectandra leucantha, foi avaliado por abordagem metabolômica global, com multiplataforma de análise (cromatografia gasosa e líquida em fase reversa hifenadas, GC-MS e RPLC-MS, respectivamente). Otimizações de preparo de amostra, extração, e derivatização para GC-MS, para obter o maior número possível de metabólitos foram realizadas nas amostras em estudo. Promastigotas de L. infantum foram crescidos em meio de cultura e após 72 h foram tratados com metildihidrodieugenol B (na concentração de 58.18 µg x mL-1); passadas 48 h de tratamento, a ação enzimática foi interrompida, as células lavadas e congeladas para análise posterior. Metanol:água (1:1) e metanol 100% foram utilizados como solventes extratores para acessar os metabólitos intracelulares nas análises por GC-MS e RPLC-MS, respectivamente. Derivatização com O-metoxiamina em piridina (15 mg x mL-1) à temperatura ambiente por 90 min, seguida de sililação com BSTFA + 1% TMCS por 30 min à 40 ºC foi realizada para tornar voláteis e estáveis os metabólitos para análise por GC-MS. Os resultados de ambas plataformas de análise apontou grandes diferenças entre os grupos de amostras tratadas e não tratadas com a substância ativa, e os metabólitos alterados com significância estatística foram correlacionados com o metabolismo de Leishmania. Diferentes aminoácidos, ácidos graxos, carboidratos, glicerolipídeos e fosfoslipídeos foram encontrados, em sua maioria, diminuídos com o tratamento. Devido a complexidade do metabolismo do parasita e a grande diversidade dos metabólitos alterados, um mecanismo de ação multi-target pode ser atribuído ao dímero de fenilpropanoide. Mudanças no metabolismo da glicólise e gluconeogênese são destacadas, indicando alterações nas fontes de energia da célula. Modificações na composição lipídica da membrana plasmática do parasita também foram observadas, sugerindo variações em sua flexibilidade e fluidez. Os resultados obtidos são preliminares, mas muito importantes para dar o primeiro passo na elucidação da ação desta substância no tratamento da leishmaniose, pleiteando a busca por novas terapias. / Leishmaniasis is a neglected disease caused by Leishmania parasites, which occurs in more than 90 countries worldwide, affecting millions of people. The disease is treatable but not curable, and the commonly used therapeutic arsenal is limited and consists in the use of highly toxic drugs. The search for new therapies has been encouraged and the use of active compounds, isolated from natural products, such as plants, has been proven effective. For future use of these active compounds in the treatment, it is necessary to understand its mechanism of action. \"Omics\" sciences, specifically metabolomics, which is the comparative analysis of altered metabolites in a biological system after external intervention, has been widely applied for this purpose. The metabolomic approach is multidisciplinary and the analyzes are performed using modern analytical platforms, such as separation techniques coupled to mass spectrometry (MS). Data treatment are performed with advanced statistical tools and altered metabolites are correlated with metabolic pathways. In this work, the mechanism of action, in Leishmania infantum, of an active compound (methyldehydrodieugenol B), isolated from Nectandra leucantha plant, was evaluated by global metabolomics approach with multiplatform analysis (gas and reversed phase liquid chromatography, GC-MS and RPLC-MS, respectively). Optimizations of sample preparation, extraction and derivatization for GC-MS to obtain the maximum number of metabolites in the samples under consideration were performed. L. infantum promastigotes were grown in culture medium and after 72 h they were treated with metildihidrodieugenol B (at a concentration of 58.18 µg x mL-1); after 48 h of treatment, enzyme activity was quenched, cells washed and frozen for further analysis. Methanol:water (1:1) and 100% methanol are used as solvent extractor to assess intracellular metabolites for analysis by GC-MS and RPLC-MS, respectively. Derivatization with O-methoxyamine in pyridine (15 mg x mL-1) at room temperature for 90 min, followed by silylation with BSTFA + 1% TMCS for 30 min at 40°C was performed to make volatile and stable metabolites for analysis by GC- MS. The results of both analytical platforms showed significant differences between treated and non-treated samples with the active substance, and altered metabolites with statistical significance were correlated with Leishmania metabolism. Different amino acids, fatty acids, carbohydrates, and glycerolipids phospholipids were found, mostly decreased with treatment. Due to the complexity of the parasite metabolism and the great diversity of altered metabolites, a multi-target mechanism can be assigned to the methyldehydrodieugenol B. Changes in the metabolism of glycolysis and gluconeogenesis are highlighted, indicating changes in the cell energy sources. Changes in the lipid composition of the parasite plasma membrane were also observed, suggesting variations in its flexibility and fluidity. The results are preliminary, but very important to take the first step into elucidation of the action of this substance in the treatment of leishmaniasis, aiming the search for new pharmaceutical therapies.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-14092016-090130 |
| Date | 03 June 2016 |
| Creators | Canuto, Gisele André Baptista |
| Contributors | Tavares, Marina Franco Maggi |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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