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Previous issue date: 2015-01 / Fundação Oswaldo Cruz, Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / As células-tronco mesenquimais (CTM) constituem uma ferramenta promissora para o campo
de terapia celular. Além de seu potencial de diferenciação em diferentes tipos celulares, as
CTM apresentam a habilidade de secretar moléculas bioativas e, assim, exercer múltiplos
efeitos biológicos, tais como indução da regeneração de tecidos lesionados, redução de fibrose
e modulação do sistema imune. A superexpressão dos fatores de crescimento G-CSF e IGF-1,
conhecidos por seus efeitos sobre os processos de imunomodulação, sobrevivência celular e
reparo tecidual, pode ampliar as ações terapêuticas das CTM. O objetivo deste trabalho
consiste em gerar e caracterizar linhagens de CTM de camundongo superexpressando hGCSF
ou hIGF-1. Um sistema lentiviral de segunda geração foi utilizado para modificação de
CTM para expressão ectópica dos genes de interesse. As sequências codificantes de hG-CSF e
hIGF-1 foram amplificadas por PCR e subclonadas em um vetor lentiviral de transferência,
contendo um promotor constitutivo. As partículas lentivirais foram produzidas a partir da cotransfecção
de células da linhagem HEK293FT com os vetores constituintes do sistema
lentiviral. Em seguida, as CTM obtidas da medula óssea de camundongos transgênicos para
proteína fluorescente verde (GFP) foram transduzidas com partículas lentivirais infectantes
contendo hG-CSF ou hIGF-1. A expressão gênica de hG-CSF ou hIGF-1 pelas linhagens
geradas foi quantificada por qRTPCR, e a produção da proteína por ELISA. As linhagens
foram caracterizadas por imunofenotipagem e avaliadas quanto ao seu potencial de
diferenciação celular. Foram geradas duas linhagens de CTM superexpressando hG-CSF e
três linhagens superexpressando hIGF-1. Todas demonstraram por qRTPCR, estar
efetivamente expressando os genes de interesse. Foi possível detectar e quantificar a síntese
proteica de G-CSF e IGF-1. Todas as linhagens geradas foram capazes de se diferenciar em
osteócitos, condrócitos e adipócitos, demonstrando a manutenção de seu fenótipo estromal.
Neste contexto, este trabalho resultou em ferramentas funcionais para a avaliação dos efeitos
terapêuticos de IGF-1 e G-CSF combinados à CTM, em modelos de lesões animais, em
comparação com CTM não-modificadas geneticamente. Além disso, estas ferramentas
poderão ser empregadas em estudos de pesquisa básica, para melhor compreensão dos efeitos
de hIGF-1 e hG-CSF sobre a biologia das CTM. / Mesenchymal stem cells (MSCs) are a promising tool for the cell therapy field. In addition to
their potential for differentiation into different cell types, MSCs have the ability to secrete
bioactive molecules and thus exert multiple biological effects such as induction of the injured
tissue regeneration, fibrosis reduction and modulation of the immune system. The
overexpression of the growth factors G-CSF and IGF-1, known for their effects on immune
modulation processes, cell survival and tissue repair, can result in a magnification of MSCs'
therapeutic actions. The objective of this work is to generate and characterize mouse MSCs
lines overexpressing hG-CSF or hIGF-1. A second generation lentiviral system was used to
modify MSCs derived from mice for the ectopic expression of the genes of interest. The
coding sequences of hG-CSF and hIGF-1 were amplified by PCR and subcloned into a
lentiviral transfer vector containing a constitutive promoter. The lentiviral particles were
produced from the co-transfection of HEK293FT lineage cells with the lentiviral vectors.
Subsequently, MSCs obtained from the bone marrow of transgenic mice for green fluorescent
protein (GFP) were transduced with infectious lentiviral particles containing hG-CSF or
hIGF-1. The gene expression of hG-CSF or hIGF-1 by the generated cell lines was quantified
by qRTPCR, and the protein production by ELISA. The lineages were characterized by
immunophenotyping and evaluated for their potential of cellular differentiation. Two lines of
MSCs overexpressing hG-CSF and three lines overexpressing hIGF-1 were generated. All the
cell lines demonstrated to be effectively expressing the genes of interest by qRTPCR. It was
possible to detect and quantify the protein synthesis of G-CSF and IGF-1. Moreover, all the
generated lines were capable of differentiating into osteocytes, chondrocytes and adipocytes,
indicating the conservation of their stromal phenotype even after genetic modification. In this
context, this study resulted in functional tools for evaluating the IGF-1 and G-CSF
therapeutic effects when combined with MSCs, to be tested in experimental animal models in
comparison to non-genetically modified MSCs. Furthermore, these tools may be employed
for basic research studies, for a better understanding of the effects of hIGF-1 and hG-CSF on
MSCs' biology
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/12758 |
| Date | January 2015 |
| Creators | Gonçalves, Gabrielle Viana Martins Gonçalves |
| Contributors | Carvalho, Rejane Hughes, Muniz, Bruno Dallagiovanna, Zanette, Dalila Luciola, Reis, Mitermayer Galvão dos, Soares, Milena Botelho Pereira |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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