RNA ist ein zentrales Molekül in der Zelle und essentiell für ihre Lebensfunktionen. Die durchschnittliche Halbwertszeit von RNA-Molekülen limitiert jedoch die zeitliche Auflösung herkömmlicher RNA-Sequenzierung, da geringe Änderungen im Transkriptom kaum zu erkennen sind, bis eine gewisse Anzahl an Molekülen akkumuliert. Durch metabolische Markierung von RNA (SLAMseq) kann die Auflösung deutlich erhöht werden. Hierfür werden der Probe markierte Nucleotide (4sU/4sUTP) zugesetzt, die dann zufällig in neu transkribierte RNA inkorporiert werden und eine Unterscheidung zwischen ‚neuer‘ und ‚alter‘ RNA erlauben.
In dieser Arbeit werden eine der ersten Einzelzell-SLAMseq-Methoden, die dazugehörige Datenanalyse-Software sowie drei Anwendungen der entwickelten Methoden vorgestellt.
Die erste Anwendung verwendet Einzelzell-SLAMseq, um zwischen maternaler (alter) und zygotischer (neuer) RNA in sich entwickelnden Zebrafischembryos bis zur Gastrulation zu unterscheiden. Im Rahmen des Projekts entstand der erste Einzelzell-SLAMseq-Datensatz in einem vollständigen Wirbeltier, der es außerdem erlaubt, im Vorfeld identifizierten lokalisierten maternalen Transkripten zeitlich zu folgen. Diese – vorher uncharakterisierten –Transkripte wurden während der Gastrulation in den Keimzellen angereichert gefunden, was Rückschlüsse auf ihre mögliche Funktion erlaubt.
Die zweite Anwendung konzentriert sich auf die neu transkribierte RNA und verwendet (Einzelzell-)SLAMseq, um Transkripte, die in Reaktion auf Stress während der Probenaufbereitung hergestellt wurden, zu identifizieren und rechnerisch zu entfernen. Die Vorteile der Methode werden in mehreren Systemen und Geweben (Mausherz, Zebrafischlarve, Maus-Microglia) demonstriert.
In der dritten Anwendung wird eine Machbarkeitsstudie für in vivo SLAMseq zur Identifikation der initialen Immunantwort nach Makrophagenstimulation präsentiert, die auf einen deutlichen Gewinn an zeitlicher Auflösung durch SLAMseq hindeutet. / RNA is a central molecule in the cell and essential to its life functions. With the average RNA half life being multiple hours, regular RNA sequencing has an intrinsic limit on temporal resolution, where small changes in the transcriptome are not picked up until a certain amount of transcripts has build up. This resolution can be greatly improved using RNA metabolic labelling (SLAMseq), where labelled nucleotides (4sU/4sUTP) are added to the samples. These nucleotides are randomly incorporated into nascent transcripts and allow distinction between RNA produced before and after introduction of the labelling agent.
This thesis presents one of the first high throughput single cell SLAMseq protocols, an accompanying computational pipeline for data analysis as well as three applications for the developed methods.
The first application uses single cell SLAMseq to distinguish between maternal (unlabelled) and zygotic (labelled) transcripts in early zebrafish development (up to mid-gastrulation). This project generated the first single cell SLAMseq dataset in a whole vertebrate. Additionally the data allows to follow a previously discovered set of vegetally localised maternal transcripts in time and determine that these specific transcripts are mainly enriched in the primordial germ cells at gastrulation, therefore ascribing a potential function to a set of so far uncharacterised genes.
The second application focuses on newly transcribed RNA and uses (single cell) SLAMseq as a technique to identify and remove transcripts generated in response to sample preparation stress. The method’s benefits are demonstrated in multiple systems and tissues, among them mouse cardiomyocytes, zebrafish larvae and mouse microglia.
Finally as the third application an in vivo proof of concept study of SLAMseq to identify first response genes in macrophage stimulation is presented, where the introduction of 4sU shows clear advantages in temporal resolution compared to unlabelled data.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/29416 |
| Date | 03 June 2024 |
| Creators | Neuschulz, Katrin Anika Elisabeth |
| Contributors | Landthaler, Markus, Junker, Jan Philipp, Rabani, Michal |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | (CC BY-NC-SA 4.0) Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International, https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ |
| Relation | 10.15252/msb.202211147, 10.1038/s41467-021-23834-1 |
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