Septinas compreendem uma conservada família de proteínas de ligação a nucleotídeo de guanina, capazes de formar filamentos. No entanto, apesar de sua importância em vários eventos celulares, ainda há pouca informação disponível no que diz respeita aos detalhes de suas funções moleculares e o mecanismo que conduz a formação de hetero-oligômeros. O objetivo desta tese foi a clonagem, co-expressão e cristalização de septinas e seus complexos (SEPT9-SEPT11-SEPT7; SEPT2-SEPT6-SEPT7-SEPT9; SEPT4-SEPT6-SEPT7 e SEPT4- SEPT8-SEPT7) seguidas por análise estrutural comparativa. Os cDNAs que codificam para as proteínas SEPT9, SEPT6, SEPT2, SEPT11, SEPT8, SEPT4, SEPT9GCα0 (resíduos 262-568) e SEPT9GC (resíduos 279-568) foram clonadas com sucesso em vetores de transferências ou de expressão. O complexo que foi melhor caracterizado, foi o composto por SEPT2-SEPT6-SEPT7-SEPT9GCα0, o qual foi confirmado por LC-MS/MS após digestão tríptica, revelando a produção in vitro de um complexo de septina tetramérico. Além disso, caracterizou-se o hetero dímero formado por SEPT7NGc-SEPT9GC. No entanto, as proteínas que foram mais plenamente investigadas foram as construções SEPT9GCα0 e SEPT9GC que foram estudados individualmente para caracterizações biofísicos e estruturais. SEPT9GCα0 apresentou-se bastante instável, porém, SEPT9GC foi eficientemente produzida e caracterizada. O estado oligomérico da proteína (monômero) foi confirmado por cromatografia de exclusão molecular. A proteína foi produzida na forma apo, e foi incapaz de hidrolisar GTP. A finidade de SEPT9GC pelos nucleotídeos GDP e GTPγS, foi avaliada por Calorimetria de Titulação Isotérmica -ITC, revelando que SEPT9GC possui uma maior afinidade por GTPγS, com Kd de 25,9 µM, o qual é dependente do íon Mg2+. Foram realizados estudos de cristalização dessa proteína, que resultou em cristais de alta resolução, com a proteína complexada a GDP e GTPγS. Interessantemente, a estrutura do complexo de SEPT9GC com o nucleotídeo GTPγS foi obtido por soaking de um cristal previamente obtido complexado com GDP. Este é o primeiro relatório da aplicação deste método para septinas. Finalmente, obtivemos três conjuntos de dados cristalográficos, dois para SEPT9GC-GDP, com resolução de 2.8 Å e 2.1Å e um conjunto de dados de SEPT9GC-GTPγS obtido a 2.8 Å. Dentre as principais características observadas na estrutura de SEPT9GC, tem-se a interface NC responsável pela polimerização dos filamentos, a qual se mostrou diferente dependendo do tipo de nucleotídeo ligado, com encurtamento do filamento na presença de GTPγS. Isso indica a comunicação entre as interfaces consecutivas G e NC ao longo do filamento. A mudança conformacional na interface envolve o rearranjo dos resíduos que são altamente conservados em todas as septinas, bem como alguns que são específicos do grupo de SEPT9 e podem ter implicações para a montagem de filamentos e de associação da membrana. / Septins belong to a highly conserved family of guanine nucleotide binding proteins, capable of forming filaments. Despite their importance for several critical cellular events including cell division, little information is available about their molecular functions and the mechanism which leads to the formation of hetero-oligomers. The aim of this thesis was the cloning, co-expression and crystallization of septins and their complexes (SEPT9-SEPT11-SEPT7; SEPT2-SEPT6-SEPT7-SEPT9; SEPT4-SEPT6-SEPT7 and SEPT4-SEPT8-SEPT7), followed by comparative structural analysis. The cDNAs coding for the proteins SEPT9, SEPT6, SEPT2, SEPT11, SEPT8, SEPT4, SEPT9GCα0 (residues 262-568) and SEPT9GC (residues 279-568) were successfully cloned into transferable or expression vectors. The best characterized complex was that composed of SEPT2-SEPT6-SEPT7-SEPT9GCα0, which was confirmed by LC-MS/MS analysis after triptic digestion, unveiling the in vitro production of a tetrameric septin complex. Additionally, we characterized the hetero-dimer formed by SEPT7NGc-SEPT9GC. However, the most fully investigated proteins were the constructs SEPT9GCα0 and SEPT9GC which were studied individually for biophysical and structural characterizations. SEPT9GCα0 was highly unstable contrasting with SEPT9GC that was efficiently produced and characterized. The presence of the oligomeric state of SEPT9GC (monomer) was confirmed by molecular exclusion chromatography. The protein was produced in the apo form and was capable of hydrolyzing GTP. The affinity of SEPT9GC for GDP and GTPγS nucleotides was evaluated by Isothermal Titration Calorimetry (ITC) revealing that SEPT9GC has a higher affinity for GTPγS, with a Kd of 25.9 µM, which is dependent on the presence of Mg2+. Crystallization studies of this protein were performed, obtaining high quality crystals of protein complexes with GDP and GTPγS. Interestingly, the structure of the complex of SEPT9GC with the nucleotide GTPγS was obtained by soaking a previously grown crystal of the GDP complex. This is the first report of the application of this method for septins. Finally, we have obtained three sets of crystallographic data, two for SEPT9GC-GDP, at resolutions of 2.8 Å and 2.1 Å, and one set of data for SEPT9GC-GTPγS at 2.8 Å. Among the main characteristics observed in the SEPT9GC structure is the NC interface responsible for filament polymerization, which is shown to vary according to the type of bound nucleotide, with foreshortening of the filament in the presence of GTPγS. This indicates communication between consecutive G and NC interfaces along the filament. The conformational change at the interface involves the rearrangement of residues which are highly conserved in all septins as well as several which are SEPT9 group specific and may have implications for filament assembly and membrane association.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-11102016-133148 |
| Date | 12 August 2016 |
| Creators | Sabrina Matos de Oliveira da Silva |
| Contributors | Richard Charles Garratt, Ana Paula Ulian de Araujo, Fernanda Canduri, Flávio Henrique da Silva |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Química, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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