Orientador: Jorg Kobarg / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campoinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T07:25:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nakahira_Marcel_D.pdf: 11988351 bytes, checksum: e05bc17d15fd4fe6b9d016e36caed880 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Septinas são proteínas que apresentam um domínio bem característico de ligação ao nucleotídeo GTP (GTPase), bem como outros dois domínios variáveis (N e C-terminais). Sua principal característica é a habilidade de interagir entre si (septinas de grupos diferentes) e de formar filamentos. Esse fato está intimamente relacionado com as funções que desempenham na citocinese, exocitose, apoptose, entre outras. Além disso, elas são direta ou indiretamente envolvidas com situações patológicas, como o mal de Alzheimer e câncer. Acredita-se que uma das suas funções moleculares é a de atuar como "andaime" (scqffòld), promovendo assim a interação entre proteínas. Com isso as funções das septinas se tornaram muito mais amplas do que se acreditava inicialmente. Por isso nosso objetivo é identificar a diversidade de proteínas que interagem com as septinas 6 e 8. Achamos que essas duas septinas interagem com quase todas as outras septinas, exceto aquelas pertencentes ao mesmo "grupo 6". As septinas presas sempre apresentavam o domínio GTPase inteiro, mostrando sua importância na interação. Com isso propusemos baseado também em informação na literatura, um modelo para as unidades formadoras (trímero) dos filamentos, onde as septinas 6 e 8 possivelmente estejam sempre na unidade central do trímero, podendo ser permutadas por outras septinas do mesmo grupo (grupo 6). Ainda identificamos várias outras proteínas que sugerem um envolvimento das septinas em processos como a divisão celular, metabolismo, transcrição, e a degradação de proteínas, entre outros. A análise da presença das septinas 6,7,8 e 9 em células de mamíferos sugere que elas sejam encontradas em estruturas que parecem ser centrossomos, os quais são realacíonados com a divisão celular. Outro estudo realizado com a septina 1 inteira e sua região GTPase mostrou que ela se encontra em solução não como monômero mas sim como um trimero/tetrâmero. O domínio GTPase assim como a presença do nucleotídeo GTP no mesmo são fundamentais para a sua multimerização e estabilidade. Em comparação com dados da literatura a SEPT1 apresenta maior estabilidade sendo mais resistente ao desenovelamento térmico. Por fim, esses e outros resultados auxiliam na compreensão das funções das septinas e sua relação com os processos celulares. / Abstract: Septins have a central domain which binds GTP (GTPase domain) and two other variable domains at their N- and C-termim Their principal characteristic is the ability to bind to other septins, thereby forming filaments. This is intimately related to their functions in cytokinesis, exocytosis, and apoptosis, among others. They are also directly or indirectly associated to pathological processes such as the Alzheimer disease and cancer. It has been suggested that one of its molecular functions may be to act as a '"scaffold" protein to promote interactions among proteins. Thereby the functions of septins have turned out to be more diverse than initially predicted. Based on this our main objective here is lo identify the diversity of proteins thai interact with the human septins 6 and 8. We found that both interact with many other different septins, including almost all of them, except for septins of the same "group 6" (septins 6,8,10,11). The prey septins identified always contained the entire GTPase domain, indicating the importance of this domain for the observed interactions. Therefore, taking also into account data from the literature, we propose a model where the central unit of the trimeric septin is always occupied by septins of the group 6, specially septins 6 and 8. We also identified several other proteins to interact with septins 6 and 8, suggest involvement in processes such as cell division, metabolism, transcription, protein degradation, among others. The analysis of the expression of the septins 6,7,8 and 9 in mammalian cells suggests that they maybe localized to centrossomal structures, which are involved in cell division. Another study which involved full length as well as only the GTPase domain of Septin 1 showed that this septin is not found as a monomer but as a trimer/tetramer in solution. The GTPase domain as well as the presence of the bound nucleotide GTP, are fundamental for its multimerizalion and stability. In comparison to data from the literature, SEPT1 presents an elevated resistance to thermal denaturation. In summary, these and other data help us to understand the function of the septins and their relationship to cellular processes. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Septinas são proteínas que ligam GTP e interagem entre si formando heterocomplexos, os quais se organizam em filamentos e estruturas de maior nível de organização. Em humanos são encontrados 13 genes que codificam septinas, as quais se dividem em 4 grupos com base na similaridade de sua organização estrutural. Análises filogenéticas identificaram quatro septinas ortólogas no deuterostômio Ciona intestinalis, as quais apresentam, cada uma, identidade com um dos quatro grupos de septinas de mamíferos. Tais proteínas foram nomeadas CiSEPT2, CiSEPT6, CiSEPT7 e CiSEPT9 devido a identidade com as septinas humanas. Sabe-se que septinas de diferentes grupos interagem entre si formando heterocomplexos e, assim, a possibilidade de formar um oligômero único em C. intestinalis permite um modelo mais simples para o estudo da organização dos filamentos. Análises de bioinformática identificaram nessas proteínas motivos estruturais típicos de septinas, incluindo resíduos conservados para a ligação e hidrólise do GTP. As proteínas foram produzidas de forma heteróloga e a capacidade hidrolítica tanto de CiSEPT2 como de CiSEPT7 foiram confirmadas diretamente. Em contrapartida, CiSEPT6 não apresentou atividade catalítica. Um sistema de coexpressão foi construído no qual as quatro septinas de C. intestinalis foram co-expressas e co-purificadas em diferentes arranjos, resultando na formação de heterocomplexos parciais além daquele contendo as quatro subunidades. A avaliação do estado oligomérico dos heterocomplexos parciais mostrou que estes correspondem majoritariamente a tetrâmeros e hexâmeros quando formados, respectivamente, por duas ou três subunidades. Estes oligômeros foram analisados por microscopia eletrônica de transmissão (MET) em que se observou que os mesmos se dispõem na forma de um bastão. Ensaios ainda mostraram que a polimerização desses oligômeros é dependente de CiSEPT2 sugerindo que esta subunidade esteja possivelmente posicionada na extremidade do heterocomplexo. Adicionalmente, ensaios de polimerização realizados com o complexo CiSEPT2/6/7/9 revelaram que este é capaz de interagir com filamentos adjacentes, possivelmente via coiled-coil, formando estruturas de mais alta ordem, similar aos já observados em S. cerevisiae. Finalmente, experimentos utilizando termoforese em microescala (MST) mostraram uma maior afinidade de interação entre as subunidades quando oligômeros estão envolvidos, indicando que estes podem atuar como fator de nucleação para a formação dos heterocomplexos. Esse trabalho apresenta os primeiros estudos de caracterização das septinas de C. intestinalis mostrando a formação do heterocomplexo e representa um modelo simplificado e viável para estudos estruturais relativos a formação de filamentos de septinas. Assim, através de uma abordagem comparativa com complexos oriundos de outros organismos, este novo complexo poderá contribuir para a compreensão do mecanismo de montagem e controle da polimerização de septinas. / Septins are GTP-binding proteins that interact with each other forming heterocomplexes, filaments and higher order structures. The human genome encodes 13 septins, which are divided into 4 subgroups based on sequence similarity. Phylogenetic analysis demonstrated that only a single representative of each of these subgroups is present in the non-vertebrate chordate Ciona intestinalis. These proteins are named CiSEPT2, CiSEPT6, CiSEPT7 and CiSEPT9 due to their great similarity with human septins. Once septins from different subgroups are able to interact among themselves to form hetero-oligomeric complex, C. intestinalis representatives can be used as a simpler model for studies of septin complex assembly. Bioinformatics analysis identified typical structural motifs of septins in these proteins, including conserved residues for binding and hydrolysis of GTP. These septins were expressed and characterized biophysically and biochemically revealing that CiSEPT2 and CiSEPT7 are capable of hydrolyzing GTP. In contrast, CiSEPT6 showed no catalytic activity. A coexpression system were designed in which the four septins of C. intestinalis were co-expressed and co-purified in different arrangements, resulting the formation of partial heterocomplexes in addition to that containing the four subunits. The oligomeric state of the partial heterocomplexes were confirmed corresponding to tetramer and hexamers when formed, respectively, by two or three subunits. Transmission electron microscopy analysis revealed that these oligomers assemblies are rod-like structures. The polymerization of these oligomers is dependent on CiSEPT2 suggesting that this subunit occupies possibly the terminal positions of the heterocomplex. Additionally, polymerization assays performed with the CiSEPT2/6/7/9 complex revealed that it is capable of interacting with adjacent filaments, possibly via coiled-coil, forming higher order structures similar to those already reported in S. cerevisiae. Finally, the interaction strenght among C. intestinalis septins were determined using microscale thermoforesis (MST), revealing a higher binding affinity when titration involves small oligomers instead of monomers, indicating that these may act as a nucleating factor for heterocomplex assembly. This work constitutes the first characterization of C. intestinalis septins presenting the heterocomplex assembly and represents a simplified and potential model for structural studies regarding the filaments assembly of septins. Thus, comparative studies involving complexes from other organisms may contribute to the understanding of the assembly mechanism and polymerization control of septins.

Septinas pertencem a uma família de proteínas de ligação a GTP e são encontradas em diversos eucariontes, participando de diferentes processos celulares citoesqueléticos. As septinas apresentam um domínio central de ligação a GTP (domínio G) flanqueado por uma região amino-terminal e outra carboxi-terminal. As septinas se caracterizam por interagirem entre si formando heterocomplexos que se polimerizam, constituindo filamentos. A única estrutura resolvida de um complexo de septinas é de um hexâmero, composto por duas subunidades de três septinas humanas diferentes: SEPT7-SEPT6-SEPT2-SEPT2-SEPT6-SEPT7. Esta estrutura revelou que a formação do filamento envolve interações conservadas entre os domínios G, estando o restante da estrutura desordenado no cristal. Além disso, mostrou que dois tipos de interface se alternam ao longo do filamento, as chamadas interfaces G (que incluem a região de ligação do nucleotídeo de duas subunidades) e interfaces NC (que incluem as regiões N e C-terminais do domínio G). Várias evidências sugerem que as regiões C-terminais da proteína sejam as principais responsáveis pela seleção do parceiro correto de interação para montagem dos heterocomplexos. Nesse contexto, buscou-se avaliar a importância das regiões C-terminais na seleção das parceiras SEPT6 e SEPT7 para formar a interface NC, frente ao domínio G. Inicialmente, uma septina quimérica foi produzida de forma a conter o domínio G de SEPT2 e o C-terminal de SEPT6, gerando SEPT2G6C. As proteínas SEPT7GC, SEPT6GC, SEPT2GC e SEPT2G6C foram expressas e purificadas separadamente. Análises de estabilidade térmica e de afinidade proteína-proteína dos pares indicou que a quimera foi capaz de interagir com SEPT7GC, gerando o heterodímero SEPT7GC-SEPT2G6C, mas este não se mostrou tão estável quanto o heterodímero fisiológico. Foi também avaliada a importância da ligação do nucleotídeo para formação da interface G e, para isso, foram construídos os mutantes SEPT2GT78M e SEPT2GD185N, cujos resíduos importantes para hidrólise e ligação do nucleotídeo, respectivamente, foram alterados. A análise de oligomerização por cromatografia de exclusão molecular mostrou deslocamento no volume de eluição das proteínas expressas sozinhas e coexpressas com SEPT6G, indicando que a formação do dímero via interface G depende da ligação do nucleotídeo, mas não da sua hidrólise. Finalmente, foi avaliada a estabilidade térmica e estrutural e a propensão à formação de amilóides do heterodímero SEPT6G-SEPT2G, o qual apresentou maior estabilidade estrutural quando comparado ao homodímero de SEPT2G, mas ainda exibiu alteração de sua estrutura para um estado capaz de ligar Thioflavina-T, sugerindo a formação de amilóides. Entretanto, isso foi observado em temperaturas cerca de 30 ºC acima daquela observada para o homodímero, confirmando a maior estabilidade do heterodímero e sugerindo que a formação da interface G com o parceiro correto pode ser um fator importante na prevenção da formação de estruturas amilóides à temperaturas fisiológicas. / Septins belong to a family of GTP binding proteins and are found in several eucaryotes, participating in different cytoskeletal cell processes. The septins have a central GTP binding domain (G domain) flanked by an amino-terminal and a carboxy-terminal regions. The septins are characterized by the ability to interact with each other forming heterocomplexes which polymerize themselves, forming filaments. The only solved structure of a septin complex is a hexamer, formed by two subunits of three different human septins: SEPT7-SEPT6-SEPT2- SEPT2-SEPT6-SEPT7. This structure revealed that the filament arrangement involves conserved interaction between G domains, being the remainder of the structure disordered in the crystal. Moreover, two types of interface alternate along the filament were shown, socalled G interfaces (which include the nucleotide binding region of the two subunits) and NC interfaces (which include the N- and C- terminal regions of G domain). Plenty of evidences suggest that C-terminal regions of the protein are the main responsible for the selection of the correct interaction partner to assembly of heterocomplexes. In this context, it was sought to evaluate the importance of the C-terminal regions in the selection of the partnerships SEPT6 and SEPT7 to form the NC interface, against the G domain. For this, a chimerical septin was designed so that contains the G-domain of SEPT2 and the C-terminal of SEPT6, creating SEPT2G6C. The SEPT7GC, SEPT6GC, SEPT2GC and SEPT2G6C proteins were expressed and purified individually. Thermal stability and protein-protein affinity analysis of the pairs indicated that the chimera was able to interact with SEPT7GC, forming the heterodimer SEPT7GC-SEPT2G6C, which, however, did not show as stable as the physiological heterodimer. The importance of nucleotide binding to the interaction through G interface was also evaluated and, for that, SEPT2 mutants on GTP-domain were constructed, SEPT2T78M and SEPT2D185N, whose important residues in the hydrolysis and linking of nucleotide, respectively, were changed. Oligomerization analysis by size exclusion chromatography showed a shift in the elution volume of proteins expressed alone and coexpressed with SEPT6, indicating that the complexation of proteins to form G interface depends on the nucleotide binding, but not on its hydrolysis. Finally, the thermal and structural stability and the propensity to amyloid formation of heterodimer SEPT6G-SEPT2G were evaluated, which showed greater structural stability when compared to SEPT2 homodimers, but still exhibited alteration of its structure to a state that was able to bind Thioflavin-T, suggesting amyloid formation. However, this was observed at temperatures around 30 ºC above that observed for the homodimer, confirming the greater conformational stability of the heterodimer and suggesting that the formation of G interface with the right partner can be an important factor of the amyloid filament prevention at physiological temperatures.

Septinas fazem parte de uma família de proteínas de ligação ao nucleotídeo guanina que atuam no ciclo de divisão celular e também são amplamente encontradas em doenças neurodegenerativas tais como mal de Parkinson e Alzheimer e em alguns tipos de câncer como leucemia, linfoma e tumores sólidos. Neste trabalho investigamos como a temperatura e a concentração impactam na agregação do domínio GTPase da septina 2 (SEPT2G), podendo levar a formação de bras amilóides, por espalhamento de luz (DLS) e Raios-X a baixos ângulos (SAXS). Resultados de DLS revelaram que a cinética de agregação da proteína é da ordem de segundos para temperaturas maiores que 25ºC. Os dados de SAXS da proteina a 0,5 mg/ml mostraram que a SETP2G é um dímero em solução aquosa a 4ºC e esta conguração se mantém estável por cerca de 1 hora de observação experimental. A 15ºC, os resultados de SAXS revelaram uma coexistência de três populações em solução compostas por 88% de dímeros, 10% de agregados pequenos tipo-cilindros (protobrilas), e 2% de agregados grandes maiores que a resolução da técnica. Após cerca de 30 minutos existe um rearranjo preferencial de dímeros em favor de agregados muito grandes cuja contribuição à curva de espalhamento torna-se 8%. A 25ºC, a porcentagem de dímeros decresce para 70% com uma contribuição de cerca de 30% de agregados grandes já no início das medidas experimentais. Nas temperaturas de 37ºC e 45ºC, dímeros e agregados muito grandes coexistem em solução desde o início das medidas experimentais, cujo equilíbrio se desloca rapidamente tal que após 20 minutos de observação a solução é composta majoritariamente por agregados muito grandes, identicados como estruturas amilóides pela técnica de uorescência da tioavina, que se intercala em estruturas cross-. A 1 mg/mL e temperatura de 4ºC, a proteína permaneceu estável durante cerca de 1 hora de observação sendo que existe um equilíbrio de dímeros (93%) com agregados alongados (contendo cerca de 80 monômeros) em solução. Com o aumento da temperatura para 15ºC, a maioria da população ainda é dimérica. Já a 25ºC, a presença de agregados muito grandes é bem significativa (da ordem de 30% coexistindo com dímeros e oligômeros). A 37ºC e 45ºC existe a formação de grandes agregados similar ao observado para a SEPT2G a 0,5 mg/mL. Em suma, os resultados de SAXS demonstraram que a SEPT2G tem uma cinética muito rápida de agregação a temperatura siológica, acentuada com o aumento de concentração da proteína em solução. / Septins are proteins from the GTP-binding family and participate in cell division cycle performing functions such as secretion and cytoskeletal division. They can also be found in neurodegenerative conditions as Alzheimer\'s and Parkinson\'s diseases and some kinds of cancer as leukemia, lymphoma and solid tumors. In this work, we investigated the influence of temperature and concentration on the septin 2 GTPase domain (SEPT2G) aggregation using dynamic light scattering (DLS) and small angle x-ray scattering (SAXS). DLS results revealed the protein aggregation kinetic is around seconds for temperatures above 25ºC. SAXS data of the protein at 0.5 mg/mL showed that SEPT2G is a dimer in aqueous solution at 4_C and this condition is kept stable for approximately one hour of experimental observation. At 15ºC, SAXS results revealed the coexistence of three populations in solution composed by 88% of dimers, 10% of cylinder-like smaller aggregates (protofibrils) and 2% of aggregates bigger than the technique detection. After 30 minutes there is a preferential rearrangement of dimers into very large aggregates which contribution on the scattering curve becomes 8%. At 25ºC, the dimers percentage decreases to 70% with a contribution of circa 30% of bigger aggregates, even at the beginning of data acquisition. At temperatures of 37ºC and 45ºC, dimers and very large aggregates coexist in solution since the beginning of data acquisition, which equilibrium quickly shifts in such a way that after 20 minutes of observation the solution is mostly composed by very large aggregates, indented as amyloid structures by the thioflavine fluorescence technique, which intercalates in the cross- structures. At 1 mg/mL and 4ºC, the protein was stable over 1 hour of observation where an equilibrium of dimers (93%) and elongated structures (composed by approximately 80 monomers) in solution takes place. Increasing the temperature to 15ºC, most of the protein remains dimeric. On the other hand, at 25ºC the very large aggregates contribution is around 30% coexisting with dimers and oligomers. At 37ºC and 45ºC there is the formation of large aggregates, similar to what was observed at 0.5 mg/mL. In conclusion, our SAXS results indicated that the aggregation process of SEPT2G in solution may follow different pathways depending on concentration and temperature.

Septinas são proteínas que ligam GTP e interagem entre si formando heterocomplexos, os quais formam filamentos e estruturas de maior nível de organização. Tais filamentos, além de se mostrarem importantes durante a citocinese também podem estar envolvidos em outros processos celulares tais como determinação da polaridade celular e reorganização do citoesqueleto. As septinas, inicialmente descobertas em Saccharomyces cerevisiae, já foram identificadas também em fungos, algas-verdes, mamíferos, porém nunca em plantas. Tipicamente, septinas apresentam três domínios estruturais compostos por um domínio central de ligação ao GTP flanqueado por um N-terminal variável e um C-terminal que pode conter sequências do tipo coiled-coil. Este trabalho teve como objetivo a caracterização do domínio de ligação a GTP da septina 8 humana (SEPT8G) por meio de estudos biofísicos. Nesse sentido, SEPT8G foi eficientemente produzida em E. coli, tendo seu estado dimérico em solução confirmado por cromatografia de exclusão molecular. Diferentemente das outras septinas já reportadas, mesmo dimérica a SEPT8G apresentou-se na forma apo. Ensaios de atividade GTPásica foram realizados, confirmando a incapacidade dessa septina em hidrolisar o GTP. Ainda, análises de estabilidade térmica por Dicroísmo Circular revelaram que a presença do íon magnésio leva à diminuição de sua estabilidade estrutural. Baseando-se em resultados prévios de interação obtidos pela técnica do duplo-híbrido em leveduras, estudos voltados à análise da interação entre as septinas 7 e 8 e, posteriormente, entre as septinas 5, 7 e 8 foram realizados. A co-purificação do complexo formado pelas septinas 7 e 8 mostrou-se dependente da região C-terminal completa de SEPT7 de modo que, quando ausente, a interação mostrou-se expressivamente prejudicada. Já o complexo formado pelas septinas 5/7/8 foi obtido contendo as três proteínas em frações equimolares e solúveis, disponibilizando assim um novo heterocomplexo de septinas para ensaios funcionais e estruturais. / Septins are GTP-binding proteins that interact with each other to form heterocomplexes, which form filaments and higher order structures. These filaments are important for cytokinesis and may be involved in other cellular processes such as the determination of cell polarity and cytoskeleton reorganization. The septins, initially discovered in Saccharomyces cerevisiae, have also been identified in fungi, green algae, mammals but not in plants. Typically, septins have three structural domains comprising a central GTP binding domain flanked by a variable N-terminal and a C-terminal which can contain coiled-coil structures. This work sought to characterize the GTP-binding domain of the human septin 8 (SEPT8G) through biophysical studies. Accordingly, SEPT8G was efficiently produced in E. coli, and its dimeric state in solution was confirmed by size exclusion chromatography. Compared to other septins previously reported, the dimeric SEPT8G presented itself as an apo-protein. GTPase activity assays were performed, confirming the inability of this septin to hidrolyse GTP. Additionally, thermal stability analyses by Circular Dichroism showed that the presence of the magnesium ion leads to a decrease of structural stability. Considering previous results of septins interactions from yeast two-hybrid experiments, we have analyzed the interaction between the septins 7, 8 and subsequently among septins 5, 7 and 8. Co-purification of the complex formed by the septins 7 and 8 showed to be dependent on the complete SEPT7 C-terminal region so that, when absent, the interaction was significantly impaired. The obtained complex formed by septins 5/7/8 contained the three proteins in soluble and equimolar fractions, providing a new septin heterocomplex for functional and structural studies.

A família das septinas caracteriza-se pela capacidade de ligar nucleotídeos de guanina e de se associarem formando filamentos. Diversas funções biológicas têm sido reportadas para esses filamentos e sua dissociação pode estar relacionada a patologias. A septina 12 humana expressa especificamente em testículos, foi identificada em filamentos que compõem o annulus do espermatozoide, cuja integridade está relacionada com a morfologia deste. Embora muitos estudos tenham sido reportados, vários aspectos das bases moleculares e fisiológicas de sua função e automontagem permanecem desconhecidos. Neste trabalho, procurou-se obter informações estruturais para o domínio de ligação ao nucleotídeo da SEPT12 (SEPT12G), do mutante SEPT12GT89M e do heterodímero SEPT7-SEPT12. A expressão destas proteínas foi realizada em células de E. coli da linhagem Rosetta(DE3) pelos vetores de expressão pET28a(+) e pETDuet-1. As etapas de purificação foram cromatografia de afinidade e exclusão molecular. A proteína SEPT12G foi submetida à avaliação do estado oligomérico, fluorescência intrínseca, ensaios de conteúdo de nucleotídeo, atividade GTPásica e transição térmica. O heterodímero SEPT7-SEPT12 foi submetido à avaliação do estado oligomérico e conteúdo de nucleotídeo. Ensaios de cristalização foram realizados para todas as proteínas. A coleta de dados realizada na linha I24 do Diamond Light Source (Didcot, Inglaterra) resultou em conjuntos de dados de alta resolução para a SET12G, SEPT12GT89M e baixa resolução para a SEPT7NGc. Os estudos biofísicos mostraram que a SEPT12G foi obtida em sua forma nativa ou, seja, capaz de ligar e hidrolisar o nucleotídeo GTP e que o heterodímero obtido apresentou ambas as proteínas. As estruturas cristalográficas foram resolvidas e permitiram realizar observações importantes para o grupo I das septinas humanas (SEPT3, SEPT9 e SEPT12). Para a SEPT12 pôde-se observar como a mudança que ocorre no motivo G4 pode alterar a estabilidade da interface G. No contexto do grupo I esta estrutura permitiu concluir que todas as proteínas deste subgrupo podem formar duas interfaces NC, dos tipos aberta e fechada. Além disso, reforçou a observação da orientação diferencial da hélice α5\', cuja função ainda não está esclarecida, mas sem dúvidas é um diferencial que caracteriza este grupo, possivelmente relacionado com a ancoragem da região polibásica na conformação aberta. A estrutura cristalográfica do mutante SEPT12T89M permitiu observar que a mutação levou a uma alteração na primeira esfera de coordenação do íon Mg2+, mudança que interrompe o mecanismo do switch universal e deixa a proteína catalíticamente inativa. Por fim, o estudo cristalográfica do complexo entre a SEPT12 e SEPT7 não foi possível, uma vez que todas as tentativas resultaram em cristais contendo apenas a SEPT7, o que pode ser consequência da precipitação da SEPT12 ou da condição de cristalização utilizada, que desestabiliza o heterodímero. / The septin family of proteins is characterized by their ability to bind guanine nucleotides and associate into filaments. Several biological functions have been reported for these filaments and their dissociation may be related to pathologies. Human septin is 12 specifically expressed in testes and has been identified in filaments that form the sperm annulus, whose integrity is related to its morphology. Although many studies have been reported, the molecular and physiological bases of septin filament function and self-assembly have yet to be completely elucidated. This study aims to obtain structural information for the nucleotide binding domain of SEPT12 (SEPT12G), the SEPT12GT89M mutant and the SEPT7-SEPT12 heterodimer. Expression of these proteins was performed in E. coli Rosetta(DE3) strain using the pET28a (+) and pETDuet-1 expression vectors. Purification was performed by affinity and size exclusion chromatography. The SEPT12G protein was submitted to an evaluation of its oligomeric state, intrinsic fluorescence, nucleotide content, GTPase activity and thermal transition. The oligomeric state and nucleotide content of SEPT7-SEPT12 was also evaluated. Crystallization assays were performed for all proteins. Data collection on line I24 of the Diamond Light Source (Didcot, England) resulted in high-resolution data sets for SET12G and SEPT12GT89M but only low resolution data for the SEPT7NGc. Biophysical studies showed that SEPT12G was obtained in its native form or, in other words, capable of binding and hydrolyzing GTP and that the purified heterodimer presented both proteins. The crystallographic structures were solved by molecular replacement allowing the identification of features characteristics of the group I septins (SEPT3, SEPT9 and SEPT12). The structure also confirmed that all the proteins of this group are able to form two different NC interfaces: open and closed. In addition, it reinforced the observation that the α5\' helix assumes a different orientation, whose function has not yet been clarified, but without doubt is a characteristic of this group which may be related to anchoring the polybasic regions whilst in the open conformation. The SEPT12T89M mutant crystal structure shows that the first shell coordination of the Mg2+ ion is altered, leading to an interruption of the universal switch mechanism and a consequent lack of catalytic activity. Finally, structural studies of the interaction between SEPT12 and SEPT7 were not possible, since all attempts resulted in crystals containing only SEPT7. This may be a consequence of SEPT12 precipitation or the crystallization condition used, destabilizing the heterodimeric interface.

As septinas são proteínas filogeneticamente classificadas na superclasse das P-loop GTPases e que, juntamente com actina, microtúbulos e filamentos intermediários, são consideradas o quarto componente do citoesqueleto. Para exercer essa função, as septinas tendem a interagir entre si formando heterocomplexos que, posteriormente, polimerizam-se em filamentos. A fim de compreender a arquitetura e dinâmica das septinas, realizou-se a caracterização estrutural e biofísica da septina 7 humana e de seus complexos com as septinas 3 e 9. Devido ao fato da septina 7 ser única em seu grupo, tem-se que a mesma é insubstituível e, portanto, está presente em todos os heterocomplexos descritos. Visando compreender os elementos moleculares responsáveis por tal unicidade, são apresentadas duas estruturas em alta resolução do domínio GTPase da septina 7 ligada a GDP. Pela primeira vez, verificou-se que o cofator Mg2+ está coordenado de uma maneira mais fraca (em relações aos padrões já descritos na literatura) e que o contato entre o switches II na interface-G (ponte-β antiparalela) aparenta estar relacionado ao fenômeno de deslizamento da fita-β3. Na verdade, os resultados indicam que tal fenômeno seria um artifício utilizado pelas septinas a fim de desestimular interfaces promíscuas. Além disso, estudos de termoestabilidade mostraram que as septinas 3 e 9 acabam por diminuir a estabilidade de seus heterodímeros com a septina 7; um resultado que pode estar relacionado com a dinâmica de formação de filamentos. Devido a uma suposta interação mais fraca, tem-se que tais septinas poderiam talvez apresentar uma maior flexibilidade na constituição dos filamentos. Por outro lado, ao realizar a mutação T282Y na septina 3, nota-se que a mesma é responsável por aumentar significativamente a termoestabilidade do heterodímero. A partir da estrutura cristalográfica deste complexo, observou-se que tal tirosina é responsável pelo estabelecimento de interações de hidrogênio com o anel guanina e com a septina 7; promovendo a estabilização da interface-G. Por último, com o intuito de identificar qual interface-NC do heterodímero constituído pelas septinas 7 e 9 é a responsável pela sua oligomerização a um tetrâmero, avaliou-se a dependência de tais septinas com a força iônica. / The septins phylogenetically belong to the P-loop GTPase superclass of proteins and, together with actin, microtubules and intermediate filaments, are considered the fourth component of the cytoskeleton. To perform this role, the septins tend to interact with each other to form heterocomplexes, which can further polymerize into filaments. In order to understand the architecture and dynamics of septins, a structural and biophysical characterization of human septin 7 and its complexes with septins 3 and 9 were performed. Since septin 7 is single in its own group, it is irreplaceable and therefore present in all heterocomplexes. Toward understanding the molecular elements responsible for such unicity, two high-resolution structures of septin 7 GTPase domain complexed with GDP are presented. For the first time, it has been found that the Mg2+ cofactor is weakly coordinated (in relation to the patterns already described in the literature) and that the contact between the switches II at the G-interface (antiparallel β-bridge) appears to be related to the phenomenon of β3-stand slippage. In fact, the results indicate this phenomenon could be thought of as a way to discourage promiscuous interfaces. In addition, thermostability assays have shown that septin 3 and 9 end up decreasing the stability of their heterodimers with septin 7; a result that may be related to the filament dynamics. Due to this supposed weaker interaction, it has been speculated that this septins could perhaps have a greater flexibility in the composition of the filaments. On the other hand, the T282Y mutation inserted into septin 3 significantly increases the heterodimer thermostability. In the crystal structure of this complex, it was observed that this particular tyrosine establishes a hydrogen bond with the guanine ring and with septin 7; promoting the stabilization of the G-interface. Finally, in order to identify which NC-interface of the heterodimer constituted by septin 7 and 9 is responsible for its oligomerization to a tetramer, the dependence of this septins with the ionic strength was analyzed.

Septinas são proteínas que ligam GTP e interagem entre si formando heterocomplexos, os quais formam filamentos e estruturas de maior nível de organização. Tais filamentos, além de se mostrarem importantes durante a citocinese também podem estar envolvidos em outros processos celulares tais como determinação da polaridade celular e reorganização do citoesqueleto. As septinas, inicialmente descobertas em Saccharomyces cerevisiae, já foram identificadas também em fungos, algas-verdes, mamíferos, porém nunca em plantas. Tipicamente, septinas apresentam três domínios estruturais compostos por um domínio central de ligação ao GTP flanqueado por um N-terminal variável e um C-terminal que pode conter sequências do tipo coiled-coil. Este trabalho teve como objetivo a caracterização do domínio de ligação a GTP da septina 8 humana (SEPT8G) por meio de estudos biofísicos. Nesse sentido, SEPT8G foi eficientemente produzida em E. coli, tendo seu estado dimérico em solução confirmado por cromatografia de exclusão molecular. Diferentemente das outras septinas já reportadas, mesmo dimérica a SEPT8G apresentou-se na forma apo. Ensaios de atividade GTPásica foram realizados, confirmando a incapacidade dessa septina em hidrolisar o GTP. Ainda, análises de estabilidade térmica por Dicroísmo Circular revelaram que a presença do íon magnésio leva à diminuição de sua estabilidade estrutural. Baseando-se em resultados prévios de interação obtidos pela técnica do duplo-híbrido em leveduras, estudos voltados à análise da interação entre as septinas 7 e 8 e, posteriormente, entre as septinas 5, 7 e 8 foram realizados. A co-purificação do complexo formado pelas septinas 7 e 8 mostrou-se dependente da região C-terminal completa de SEPT7 de modo que, quando ausente, a interação mostrou-se expressivamente prejudicada. Já o complexo formado pelas septinas 5/7/8 foi obtido contendo as três proteínas em frações equimolares e solúveis, disponibilizando assim um novo heterocomplexo de septinas para ensaios funcionais e estruturais. / Septins are GTP-binding proteins that interact with each other to form heterocomplexes, which form filaments and higher order structures. These filaments are important for cytokinesis and may be involved in other cellular processes such as the determination of cell polarity and cytoskeleton reorganization. The septins, initially discovered in Saccharomyces cerevisiae, have also been identified in fungi, green algae, mammals but not in plants. Typically, septins have three structural domains comprising a central GTP binding domain flanked by a variable N-terminal and a C-terminal which can contain coiled-coil structures. This work sought to characterize the GTP-binding domain of the human septin 8 (SEPT8G) through biophysical studies. Accordingly, SEPT8G was efficiently produced in E. coli, and its dimeric state in solution was confirmed by size exclusion chromatography. Compared to other septins previously reported, the dimeric SEPT8G presented itself as an apo-protein. GTPase activity assays were performed, confirming the inability of this septin to hidrolyse GTP. Additionally, thermal stability analyses by Circular Dichroism showed that the presence of the magnesium ion leads to a decrease of structural stability. Considering previous results of septins interactions from yeast two-hybrid experiments, we have analyzed the interaction between the septins 7, 8 and subsequently among septins 5, 7 and 8. Co-purification of the complex formed by the septins 7 and 8 showed to be dependent on the complete SEPT7 C-terminal region so that, when absent, the interaction was significantly impaired. The obtained complex formed by septins 5/7/8 contained the three proteins in soluble and equimolar fractions, providing a new septin heterocomplex for functional and structural studies.

Septinas pertencem a uma família de proteínas de ligação a GTP e são encontradas em diversos eucariontes, participando de diferentes processos celulares citoesqueléticos. As septinas apresentam um domínio central de ligação a GTP (domínio G) flanqueado por uma região amino-terminal e outra carboxi-terminal. As septinas se caracterizam por interagirem entre si formando heterocomplexos que se polimerizam, constituindo filamentos. A única estrutura resolvida de um complexo de septinas é de um hexâmero, composto por duas subunidades de três septinas humanas diferentes: SEPT7-SEPT6-SEPT2-SEPT2-SEPT6-SEPT7. Esta estrutura revelou que a formação do filamento envolve interações conservadas entre os domínios G, estando o restante da estrutura desordenado no cristal. Além disso, mostrou que dois tipos de interface se alternam ao longo do filamento, as chamadas interfaces G (que incluem a região de ligação do nucleotídeo de duas subunidades) e interfaces NC (que incluem as regiões N e C-terminais do domínio G). Várias evidências sugerem que as regiões C-terminais da proteína sejam as principais responsáveis pela seleção do parceiro correto de interação para montagem dos heterocomplexos. Nesse contexto, buscou-se avaliar a importância das regiões C-terminais na seleção das parceiras SEPT6 e SEPT7 para formar a interface NC, frente ao domínio G. Inicialmente, uma septina quimérica foi produzida de forma a conter o domínio G de SEPT2 e o C-terminal de SEPT6, gerando SEPT2G6C. As proteínas SEPT7GC, SEPT6GC, SEPT2GC e SEPT2G6C foram expressas e purificadas separadamente. Análises de estabilidade térmica e de afinidade proteína-proteína dos pares indicou que a quimera foi capaz de interagir com SEPT7GC, gerando o heterodímero SEPT7GC-SEPT2G6C, mas este não se mostrou tão estável quanto o heterodímero fisiológico. Foi também avaliada a importância da ligação do nucleotídeo para formação da interface G e, para isso, foram construídos os mutantes SEPT2GT78M e SEPT2GD185N, cujos resíduos importantes para hidrólise e ligação do nucleotídeo, respectivamente, foram alterados. A análise de oligomerização por cromatografia de exclusão molecular mostrou deslocamento no volume de eluição das proteínas expressas sozinhas e coexpressas com SEPT6G, indicando que a formação do dímero via interface G depende da ligação do nucleotídeo, mas não da sua hidrólise. Finalmente, foi avaliada a estabilidade térmica e estrutural e a propensão à formação de amilóides do heterodímero SEPT6G-SEPT2G, o qual apresentou maior estabilidade estrutural quando comparado ao homodímero de SEPT2G, mas ainda exibiu alteração de sua estrutura para um estado capaz de ligar Thioflavina-T, sugerindo a formação de amilóides. Entretanto, isso foi observado em temperaturas cerca de 30 ºC acima daquela observada para o homodímero, confirmando a maior estabilidade do heterodímero e sugerindo que a formação da interface G com o parceiro correto pode ser um fator importante na prevenção da formação de estruturas amilóides à temperaturas fisiológicas. / Septins belong to a family of GTP binding proteins and are found in several eucaryotes, participating in different cytoskeletal cell processes. The septins have a central GTP binding domain (G domain) flanked by an amino-terminal and a carboxy-terminal regions. The septins are characterized by the ability to interact with each other forming heterocomplexes which polymerize themselves, forming filaments. The only solved structure of a septin complex is a hexamer, formed by two subunits of three different human septins: SEPT7-SEPT6-SEPT2- SEPT2-SEPT6-SEPT7. This structure revealed that the filament arrangement involves conserved interaction between G domains, being the remainder of the structure disordered in the crystal. Moreover, two types of interface alternate along the filament were shown, socalled G interfaces (which include the nucleotide binding region of the two subunits) and NC interfaces (which include the N- and C- terminal regions of G domain). Plenty of evidences suggest that C-terminal regions of the protein are the main responsible for the selection of the correct interaction partner to assembly of heterocomplexes. In this context, it was sought to evaluate the importance of the C-terminal regions in the selection of the partnerships SEPT6 and SEPT7 to form the NC interface, against the G domain. For this, a chimerical septin was designed so that contains the G-domain of SEPT2 and the C-terminal of SEPT6, creating SEPT2G6C. The SEPT7GC, SEPT6GC, SEPT2GC and SEPT2G6C proteins were expressed and purified individually. Thermal stability and protein-protein affinity analysis of the pairs indicated that the chimera was able to interact with SEPT7GC, forming the heterodimer SEPT7GC-SEPT2G6C, which, however, did not show as stable as the physiological heterodimer. The importance of nucleotide binding to the interaction through G interface was also evaluated and, for that, SEPT2 mutants on GTP-domain were constructed, SEPT2T78M and SEPT2D185N, whose important residues in the hydrolysis and linking of nucleotide, respectively, were changed. Oligomerization analysis by size exclusion chromatography showed a shift in the elution volume of proteins expressed alone and coexpressed with SEPT6, indicating that the complexation of proteins to form G interface depends on the nucleotide binding, but not on its hydrolysis. Finally, the thermal and structural stability and the propensity to amyloid formation of heterodimer SEPT6G-SEPT2G were evaluated, which showed greater structural stability when compared to SEPT2 homodimers, but still exhibited alteration of its structure to a state that was able to bind Thioflavin-T, suggesting amyloid formation. However, this was observed at temperatures around 30 ºC above that observed for the homodimer, confirming the greater conformational stability of the heterodimer and suggesting that the formation of G interface with the right partner can be an important factor of the amyloid filament prevention at physiological temperatures.

Orientador: João Alexandre Ribeiro Gonçalves Barbosa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-15T21:46:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_TatianadeArrudaCamposBrasilde_D.pdf: 2667585 bytes, checksum: 67a64b614fe46e32c061e0f43f20406e (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Para que a divisão celular ocorra é necessário que uma célula passe por algumas etapas que possibilitem esta divisão. Ao conjunto destes processos denomina-se ciclo celular. A regulação espacial e temporal destes processos é fundamental para a preservação celular e do material genético. Falha neste processo pode levar à morte celular ou a alterações genéticas causando divisão desregulada e crescimento de tumores. Dentre diversas proteínas envolvidas no ciclo celular, encontram-se as septinas. Até o momento, foram encontrados em humanos 14 diferentes genes para septinas. Septinas são proteínas ligadoras de GTP, primeiramente caracterizadas em leveduras, que estão associadas a eventos biológicos importantes em eucariotos. Neste trabalho foram selecionadas três septinas humanas para estudos funcionais e estruturais: septina 6, septina 8 e septina 10. Nossos resultados deram origem a três artigos que descrevem: I) estratégias de clonagem, expressão, purificação e caracterização preliminar da septina humana 8; II) a capacidade das septinas 2, 6, 8 e 11 em ligar e hidrolisar GTP, mas com diferentes níveis de atividade GTPásica, sendo a septina 2 humana capaz de hidrolizar GTP mais rapidamente que as demais septinas e III) a interação entre a septina 10 humana e a proteína Promyelocytic leukemia zinc finger (PLZF), cuja expressão em linhagens celulares hematopoiéticas resultam na supressão do crescimento e interrupção do ciclo celular. A interação da septina 10 com a proteína PLZF foi confirmada in vitro por experimento de pull-down e a localização celular da septina 10 mostra que esta septina é expressa no citoplasma da célula. Além disso, resultados preliminares mostram a relação da ligação de GTP e formação de filamentos pela septina 6 e diversas estratégias para a cristalização das septinas estudadas como: microseeding, streak-seeding, variações de pH, precipitantes e aditivos, metilação de lisinas e screening de tampões, cujos resultados não foram satisfatórios para a resolução de uma estrutura de septina humana / Abstract: A cell passes through some steps to enable for cell division and all these processes are called Cell Cycle. The spatial and temporal regulation of this process is crucial to maintaining cellular and genetic material. Failure in this process can lead to cell death or genetic changes causing division and unregulated growth of tumors. Among several proteins involved in cell cycle, there are the septins. To date, 14 different human genes coding for septins were found. Septins are GTP binding proteins first characterized in yeast, which are associated with important biological events in eukaryotes. In this study we selected three human septins to study functionally and structurally: septin 6, septin 8 and septin 10. Our results led to three articles that describe: i) strategies for cloning, expression, purification and preliminary characterization of human septin 8; ii) the ability of septin 2, 6, 8 and 11 to bind and hydrolyze GTP, but with different levels GTPase activity, human septin 2 is capable of hydrolyzing GTP faster than the other septins and III) the interaction between the human septin 10 and promyelocytic leukemia zinc finger protein (PLZF), whose expression in hematopoietic cell lines results in growth suppression and cell cycle arrest. The interaction between septin 10 and PLZF was confirmed by in vitro pull down assay and the cellular localization of septin 10 shows that this septin is expressed in the cell cytoplasm. Furthermore, our studies preliminary results show the relation of GTP binding and filament formation of the septin 6 and several strategies for the crystallization of septins as micro-seeding, streak-seeding, variations in pH, precipitants and additives, methylation of lysine and screening of buffers, but the results were not satisfactory for the resolution of a human septin structure / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular