Septinas são proteínas que ligam GTP e interagem entre si formando heterocomplexos, os quais formam filamentos e estruturas de maior nível de organização. Tais filamentos, além de se mostrarem importantes durante a citocinese também podem estar envolvidos em outros processos celulares tais como determinação da polaridade celular e reorganização do citoesqueleto. As septinas, inicialmente descobertas em Saccharomyces cerevisiae, já foram identificadas também em fungos, algas-verdes, mamíferos, porém nunca em plantas. Tipicamente, septinas apresentam três domínios estruturais compostos por um domínio central de ligação ao GTP flanqueado por um N-terminal variável e um C-terminal que pode conter sequências do tipo coiled-coil. Este trabalho teve como objetivo a caracterização do domínio de ligação a GTP da septina 8 humana (SEPT8G) por meio de estudos biofísicos. Nesse sentido, SEPT8G foi eficientemente produzida em E. coli, tendo seu estado dimérico em solução confirmado por cromatografia de exclusão molecular. Diferentemente das outras septinas já reportadas, mesmo dimérica a SEPT8G apresentou-se na forma apo. Ensaios de atividade GTPásica foram realizados, confirmando a incapacidade dessa septina em hidrolisar o GTP. Ainda, análises de estabilidade térmica por Dicroísmo Circular revelaram que a presença do íon magnésio leva à diminuição de sua estabilidade estrutural. Baseando-se em resultados prévios de interação obtidos pela técnica do duplo-híbrido em leveduras, estudos voltados à análise da interação entre as septinas 7 e 8 e, posteriormente, entre as septinas 5, 7 e 8 foram realizados. A co-purificação do complexo formado pelas septinas 7 e 8 mostrou-se dependente da região C-terminal completa de SEPT7 de modo que, quando ausente, a interação mostrou-se expressivamente prejudicada. Já o complexo formado pelas septinas 5/7/8 foi obtido contendo as três proteínas em frações equimolares e solúveis, disponibilizando assim um novo heterocomplexo de septinas para ensaios funcionais e estruturais. / Septins are GTP-binding proteins that interact with each other to form heterocomplexes, which form filaments and higher order structures. These filaments are important for cytokinesis and may be involved in other cellular processes such as the determination of cell polarity and cytoskeleton reorganization. The septins, initially discovered in Saccharomyces cerevisiae, have also been identified in fungi, green algae, mammals but not in plants. Typically, septins have three structural domains comprising a central GTP binding domain flanked by a variable N-terminal and a C-terminal which can contain coiled-coil structures. This work sought to characterize the GTP-binding domain of the human septin 8 (SEPT8G) through biophysical studies. Accordingly, SEPT8G was efficiently produced in E. coli, and its dimeric state in solution was confirmed by size exclusion chromatography. Compared to other septins previously reported, the dimeric SEPT8G presented itself as an apo-protein. GTPase activity assays were performed, confirming the inability of this septin to hidrolyse GTP. Additionally, thermal stability analyses by Circular Dichroism showed that the presence of the magnesium ion leads to a decrease of structural stability. Considering previous results of septins interactions from yeast two-hybrid experiments, we have analyzed the interaction between the septins 7, 8 and subsequently among septins 5, 7 and 8. Co-purification of the complex formed by the septins 7 and 8 showed to be dependent on the complete SEPT7 C-terminal region so that, when absent, the interaction was significantly impaired. The obtained complex formed by septins 5/7/8 contained the three proteins in soluble and equimolar fractions, providing a new septin heterocomplex for functional and structural studies.

Septinas são proteínas que ligam GTP e interagem entre si formando heterocomplexos, os quais formam filamentos e estruturas de maior nível de organização. Tais filamentos, além de se mostrarem importantes durante a citocinese também podem estar envolvidos em outros processos celulares tais como determinação da polaridade celular e reorganização do citoesqueleto. As septinas, inicialmente descobertas em Saccharomyces cerevisiae, já foram identificadas também em fungos, algas-verdes, mamíferos, porém nunca em plantas. Tipicamente, septinas apresentam três domínios estruturais compostos por um domínio central de ligação ao GTP flanqueado por um N-terminal variável e um C-terminal que pode conter sequências do tipo coiled-coil. Este trabalho teve como objetivo a caracterização do domínio de ligação a GTP da septina 8 humana (SEPT8G) por meio de estudos biofísicos. Nesse sentido, SEPT8G foi eficientemente produzida em E. coli, tendo seu estado dimérico em solução confirmado por cromatografia de exclusão molecular. Diferentemente das outras septinas já reportadas, mesmo dimérica a SEPT8G apresentou-se na forma apo. Ensaios de atividade GTPásica foram realizados, confirmando a incapacidade dessa septina em hidrolisar o GTP. Ainda, análises de estabilidade térmica por Dicroísmo Circular revelaram que a presença do íon magnésio leva à diminuição de sua estabilidade estrutural. Baseando-se em resultados prévios de interação obtidos pela técnica do duplo-híbrido em leveduras, estudos voltados à análise da interação entre as septinas 7 e 8 e, posteriormente, entre as septinas 5, 7 e 8 foram realizados. A co-purificação do complexo formado pelas septinas 7 e 8 mostrou-se dependente da região C-terminal completa de SEPT7 de modo que, quando ausente, a interação mostrou-se expressivamente prejudicada. Já o complexo formado pelas septinas 5/7/8 foi obtido contendo as três proteínas em frações equimolares e solúveis, disponibilizando assim um novo heterocomplexo de septinas para ensaios funcionais e estruturais. / Septins are GTP-binding proteins that interact with each other to form heterocomplexes, which form filaments and higher order structures. These filaments are important for cytokinesis and may be involved in other cellular processes such as the determination of cell polarity and cytoskeleton reorganization. The septins, initially discovered in Saccharomyces cerevisiae, have also been identified in fungi, green algae, mammals but not in plants. Typically, septins have three structural domains comprising a central GTP binding domain flanked by a variable N-terminal and a C-terminal which can contain coiled-coil structures. This work sought to characterize the GTP-binding domain of the human septin 8 (SEPT8G) through biophysical studies. Accordingly, SEPT8G was efficiently produced in E. coli, and its dimeric state in solution was confirmed by size exclusion chromatography. Compared to other septins previously reported, the dimeric SEPT8G presented itself as an apo-protein. GTPase activity assays were performed, confirming the inability of this septin to hidrolyse GTP. Additionally, thermal stability analyses by Circular Dichroism showed that the presence of the magnesium ion leads to a decrease of structural stability. Considering previous results of septins interactions from yeast two-hybrid experiments, we have analyzed the interaction between the septins 7, 8 and subsequently among septins 5, 7 and 8. Co-purification of the complex formed by the septins 7 and 8 showed to be dependent on the complete SEPT7 C-terminal region so that, when absent, the interaction was significantly impaired. The obtained complex formed by septins 5/7/8 contained the three proteins in soluble and equimolar fractions, providing a new septin heterocomplex for functional and structural studies.

Septinas compreendem uma conservada família de proteínas de ligação a nucleotídeo de guanina, capazes de formar filamentos. No entanto, apesar de sua importância em vários eventos celulares, ainda há pouca informação disponível no que diz respeita aos detalhes de suas funções moleculares e o mecanismo que conduz a formação de hetero-oligômeros. O objetivo desta tese foi a clonagem, co-expressão e cristalização de septinas e seus complexos (SEPT9-SEPT11-SEPT7; SEPT2-SEPT6-SEPT7-SEPT9; SEPT4-SEPT6-SEPT7 e SEPT4- SEPT8-SEPT7) seguidas por análise estrutural comparativa. Os cDNAs que codificam para as proteínas SEPT9, SEPT6, SEPT2, SEPT11, SEPT8, SEPT4, SEPT9GCα0 (resíduos 262-568) e SEPT9GC (resíduos 279-568) foram clonadas com sucesso em vetores de transferências ou de expressão. O complexo que foi melhor caracterizado, foi o composto por SEPT2-SEPT6-SEPT7-SEPT9GCα0, o qual foi confirmado por LC-MS/MS após digestão tríptica, revelando a produção in vitro de um complexo de septina tetramérico. Além disso, caracterizou-se o hetero dímero formado por SEPT7NGc-SEPT9GC. No entanto, as proteínas que foram mais plenamente investigadas foram as construções SEPT9GCα0 e SEPT9GC que foram estudados individualmente para caracterizações biofísicos e estruturais. SEPT9GCα0 apresentou-se bastante instável, porém, SEPT9GC foi eficientemente produzida e caracterizada. O estado oligomérico da proteína (monômero) foi confirmado por cromatografia de exclusão molecular. A proteína foi produzida na forma apo, e foi incapaz de hidrolisar GTP. A finidade de SEPT9GC pelos nucleotídeos GDP e GTPγS, foi avaliada por Calorimetria de Titulação Isotérmica -ITC, revelando que SEPT9GC possui uma maior afinidade por GTPγS, com Kd de 25,9 µM, o qual é dependente do íon Mg2+. Foram realizados estudos de cristalização dessa proteína, que resultou em cristais de alta resolução, com a proteína complexada a GDP e GTPγS. Interessantemente, a estrutura do complexo de SEPT9GC com o nucleotídeo GTPγS foi obtido por soaking de um cristal previamente obtido complexado com GDP. Este é o primeiro relatório da aplicação deste método para septinas. Finalmente, obtivemos três conjuntos de dados cristalográficos, dois para SEPT9GC-GDP, com resolução de 2.8 Å e 2.1Å e um conjunto de dados de SEPT9GC-GTPγS obtido a 2.8 Å. Dentre as principais características observadas na estrutura de SEPT9GC, tem-se a interface NC responsável pela polimerização dos filamentos, a qual se mostrou diferente dependendo do tipo de nucleotídeo ligado, com encurtamento do filamento na presença de GTPγS. Isso indica a comunicação entre as interfaces consecutivas G e NC ao longo do filamento. A mudança conformacional na interface envolve o rearranjo dos resíduos que são altamente conservados em todas as septinas, bem como alguns que são específicos do grupo de SEPT9 e podem ter implicações para a montagem de filamentos e de associação da membrana. / Septins belong to a highly conserved family of guanine nucleotide binding proteins, capable of forming filaments. Despite their importance for several critical cellular events including cell division, little information is available about their molecular functions and the mechanism which leads to the formation of hetero-oligomers. The aim of this thesis was the cloning, co-expression and crystallization of septins and their complexes (SEPT9-SEPT11-SEPT7; SEPT2-SEPT6-SEPT7-SEPT9; SEPT4-SEPT6-SEPT7 and SEPT4-SEPT8-SEPT7), followed by comparative structural analysis. The cDNAs coding for the proteins SEPT9, SEPT6, SEPT2, SEPT11, SEPT8, SEPT4, SEPT9GCα0 (residues 262-568) and SEPT9GC (residues 279-568) were successfully cloned into transferable or expression vectors. The best characterized complex was that composed of SEPT2-SEPT6-SEPT7-SEPT9GCα0, which was confirmed by LC-MS/MS analysis after triptic digestion, unveiling the in vitro production of a tetrameric septin complex. Additionally, we characterized the hetero-dimer formed by SEPT7NGc-SEPT9GC. However, the most fully investigated proteins were the constructs SEPT9GCα0 and SEPT9GC which were studied individually for biophysical and structural characterizations. SEPT9GCα0 was highly unstable contrasting with SEPT9GC that was efficiently produced and characterized. The presence of the oligomeric state of SEPT9GC (monomer) was confirmed by molecular exclusion chromatography. The protein was produced in the apo form and was capable of hydrolyzing GTP. The affinity of SEPT9GC for GDP and GTPγS nucleotides was evaluated by Isothermal Titration Calorimetry (ITC) revealing that SEPT9GC has a higher affinity for GTPγS, with a Kd of 25.9 µM, which is dependent on the presence of Mg2+. Crystallization studies of this protein were performed, obtaining high quality crystals of protein complexes with GDP and GTPγS. Interestingly, the structure of the complex of SEPT9GC with the nucleotide GTPγS was obtained by soaking a previously grown crystal of the GDP complex. This is the first report of the application of this method for septins. Finally, we have obtained three sets of crystallographic data, two for SEPT9GC-GDP, at resolutions of 2.8 Å and 2.1 Å, and one set of data for SEPT9GC-GTPγS at 2.8 Å. Among the main characteristics observed in the SEPT9GC structure is the NC interface responsible for filament polymerization, which is shown to vary according to the type of bound nucleotide, with foreshortening of the filament in the presence of GTPγS. This indicates communication between consecutive G and NC interfaces along the filament. The conformational change at the interface involves the rearrangement of residues which are highly conserved in all septins as well as several which are SEPT9 group specific and may have implications for filament assembly and membrane association.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Oxidase Alternativa (AOX) em plantas à codificada por uma pequena famÃlia multigÃnica de origem nuclear (DNA genÃmico). Essa famÃlia multigÃnica foi bem estudada em mono e dicotiledÃneas sendo subdividida em duas subfamÃlias: Aox1 e Aox2. Os genes Aox1 sÃo encontrados em mono e eudicotiledÃneas apresentando expressÃo mais relacionada a condiÃÃes de estresses enquanto que os genes Aox2 sÃo encontrados apenas em eudicotiledÃneas com expressÃo constitutiva. VÃrios genes Aox1 e apenas hum gene Aox2 sÃo encontrados na maioria das eudicotiledÃneas estudadas. Nesse trabalho, caracterizou-se a famÃlia multigÃnica da Aox no gÃnero Medicago (Medicago truncatula e Medicago sativa) pertencente à ordem Fabales. Em Medicago truncatula, a famÃlia multigÃnica da Aox foi carcterizada atravÃs de busca por bioinformÃtica em bancos de dados identificando-se 4 genes Aox (Aox1, Aox2a, Aox2b1 e Aox2b2) no genoma dessa espÃcie revelando pela primeira vez uma duplicaÃÃo do gene Aox2b. OligonucleotÃdeos especÃficos desenhados para cada um dos genes foram usados para amplificaÃÃo por PCR, clonagem e seqÃenciamento parcial dos referidos genes em Medicago sativa. A expressÃo gÃnica foi estudada, atravÃs de RT-PCR semiquantitativa, em sementes durante a germinaÃÃo (0, 24 e 48 horas de apÃs embebiÃÃo) e em raÃzes e folhas de Medicago sativa crescidas em meio hidropÃnico de Hoagland e submetidas a diferentes condiÃÃes de estresse (0, 6, 12 e 24 hs apÃs tratamento): controle, Ãcido salicÃlico (0,5 mM), PEG (100 g/L), H2O2 (10 mM) e cisteÃna (0,5 mM). Os resultados revelaram que todos os 4 genes Aox foram detectados em sementes de Medicago sativa, entretanto os genes Aox1, 2b1 e 2b2 apresentaram aumento da expressÃo durante a germinaÃÃo enquanto que o Aox2a mostrou-se constitutivo. Em folhas os genes Aox1, 2a e 2b1 foram detectados em todas as condiÃÃes testadas jà o Aox2b2 foi detectado mais intensamente apenas nas condiÃÃes de estresse. De maneira semelhante ao observado durante a germinaÃÃo os genes Aox1, 2b1 e 2b2 tiveram expressÃo aumentada em resposta a todas as condiÃÃes de estresse. O Aox2a mostrou-se constitutivo, mas foi intensamente expresso. Em raÃzes, todos os genes foram detectados e um perfil semelhante de induÃÃo dos genes Aox1, 2b1 e 2b2 tambÃm foi observado com exceÃÃo do tratamento com PEG onde apenas Aox1 foi induzido. O Aox2a tambÃm se mostrou constitutivo, mas foi fracamente expresso. Com a finalidade de se compreender melhor a co-expressÃo dos genes Aox1, 2b1 e 2b2 em Medicago sativa os promotores foram clonados e seqÃenciados revelando regiÃes idÃnticas entre eles indicando o envolvimento de elementos cis comuns na regulaÃÃo. Esses resultados corroboram com a co-expressÃo induzida por estresse de Aox1/Aox2b observada anteriormente em feijÃo. Contudo, em Medicago sativa, observamos expressÃo diferencial entre tecidos: no tecido radicular os genes Aox1, Aox2a e 2b1 podem sem induzidos por estresses e/ou mostram uma caracterÃstica de expressÃo. Por outro lado, em folhas o gene Aox2b2 diferenciou por apresentar apenas caracterÃstica de gene induzido em condiÃÃes de estresse. / In plants, Alternative Oxidase (AOX) is enconded by small milti gene family located in genomc DNA. This multi gene family was studied in mono and dicots plants being clusterd in two subfamilies: Aox1 and Aox2. Aox1 gene are found in all angiosperms tÃxon presenting gene expression related to stress situations while Aox2 genes are found in dicots plants only and presenting a houkeeping expression. Many Aox1 genes e just one Aox2 are found in the most of dicots studied. However, in Fabales, as cowpea and soybean, is found a profile with two genes Aox2 (Aox2a , Aox2b) and one Aox1 gene. In this work was characterized a multi gene family of Aox genes in Medicago genus (Medicago truncatula e Medicago sativa) belonging to Fabales Order. Data mining in genBanks characterized four Aox genes (Aox1, Aox2a, Aox2b1 and Aox2b2) in Medicago truncatula genome revealing for first time a duplication of Aox2b genes. Specifics primers designed for each Aox gene and then were used to amplification by PCR, cloning and partial sequencing of these genes in Medicago sativa. Gene expression was carried out by semiquantitative RT-PCR in: germination seeds (0, 24, 48 hours of germination), roots and leaves from Medicago sativa grewth in Hoaglendâs medium and applied to disticts stress conditions (0, 6, 12 e 24 hs after treatment): control, salicylic acid (0,5mM), PEG (100g/L), H2O2 (10mM) e cisteÃne (0,5mM). The results revealed that all four Aox genes were detected in seed of Medicago sativa. However, Aox1, Aox2b1 and Aox2b2 genes presented high expression during germination while Aox2a showed constitutive expression. In leaves, Aox1, Aox2a and Aox2b1 were detected in all conditions tested, but Aox2b2 was observed more strong in stress situations only. Simirily observed in germination, Aox1, Aox2b1 and Aox2b2 increased transcripts levels in response to all stress conditions. Aox2a, one more time, had constitutive, but very strong expression. In roots, all genes were detected and a similar induction profile of Aox1, Aox2b1 and Aox2b2 were confirmed less to PEG treatment where just Aox1 was responsive. Aox2a had constitutive expression too, but it was weakly expressed. In order to understand the co-expresion of Aox1, Aox2b1 and Aox2b2 genes, the promoter regions were cloned and sequenced revealing close motifs among them suggesting th involviment of cis-elements in their regulation. Theses resuls corroborate with co-expression stress-induced of Aox1/Aox2b found in cowpea. However, in Medicago sativa, it was observed tissue-specific exression. Aox1, Aox2a and Aox2b1 with characteristics constitutive and induced in seeds germination and roots tissue while in leaves Aox2b2 differed by present stress-induced expression only.

Septinas compreendem uma conservada família de proteínas de ligação a nucleotídeo de guanina, capazes de formar filamentos. No entanto, apesar de sua importância em vários eventos celulares, ainda há pouca informação disponível no que diz respeita aos detalhes de suas funções moleculares e o mecanismo que conduz a formação de hetero-oligômeros. O objetivo desta tese foi a clonagem, co-expressão e cristalização de septinas e seus complexos (SEPT9-SEPT11-SEPT7; SEPT2-SEPT6-SEPT7-SEPT9; SEPT4-SEPT6-SEPT7 e SEPT4- SEPT8-SEPT7) seguidas por análise estrutural comparativa. Os cDNAs que codificam para as proteínas SEPT9, SEPT6, SEPT2, SEPT11, SEPT8, SEPT4, SEPT9GCα0 (resíduos 262-568) e SEPT9GC (resíduos 279-568) foram clonadas com sucesso em vetores de transferências ou de expressão. O complexo que foi melhor caracterizado, foi o composto por SEPT2-SEPT6-SEPT7-SEPT9GCα0, o qual foi confirmado por LC-MS/MS após digestão tríptica, revelando a produção in vitro de um complexo de septina tetramérico. Além disso, caracterizou-se o hetero dímero formado por SEPT7NGc-SEPT9GC. No entanto, as proteínas que foram mais plenamente investigadas foram as construções SEPT9GCα0 e SEPT9GC que foram estudados individualmente para caracterizações biofísicos e estruturais. SEPT9GCα0 apresentou-se bastante instável, porém, SEPT9GC foi eficientemente produzida e caracterizada. O estado oligomérico da proteína (monômero) foi confirmado por cromatografia de exclusão molecular. A proteína foi produzida na forma apo, e foi incapaz de hidrolisar GTP. A finidade de SEPT9GC pelos nucleotídeos GDP e GTPγS, foi avaliada por Calorimetria de Titulação Isotérmica -ITC, revelando que SEPT9GC possui uma maior afinidade por GTPγS, com Kd de 25,9 µM, o qual é dependente do íon Mg2+. Foram realizados estudos de cristalização dessa proteína, que resultou em cristais de alta resolução, com a proteína complexada a GDP e GTPγS. Interessantemente, a estrutura do complexo de SEPT9GC com o nucleotídeo GTPγS foi obtido por soaking de um cristal previamente obtido complexado com GDP. Este é o primeiro relatório da aplicação deste método para septinas. Finalmente, obtivemos três conjuntos de dados cristalográficos, dois para SEPT9GC-GDP, com resolução de 2.8 Å e 2.1Å e um conjunto de dados de SEPT9GC-GTPγS obtido a 2.8 Å. Dentre as principais características observadas na estrutura de SEPT9GC, tem-se a interface NC responsável pela polimerização dos filamentos, a qual se mostrou diferente dependendo do tipo de nucleotídeo ligado, com encurtamento do filamento na presença de GTPγS. Isso indica a comunicação entre as interfaces consecutivas G e NC ao longo do filamento. A mudança conformacional na interface envolve o rearranjo dos resíduos que são altamente conservados em todas as septinas, bem como alguns que são específicos do grupo de SEPT9 e podem ter implicações para a montagem de filamentos e de associação da membrana. / Septins belong to a highly conserved family of guanine nucleotide binding proteins, capable of forming filaments. Despite their importance for several critical cellular events including cell division, little information is available about their molecular functions and the mechanism which leads to the formation of hetero-oligomers. The aim of this thesis was the cloning, co-expression and crystallization of septins and their complexes (SEPT9-SEPT11-SEPT7; SEPT2-SEPT6-SEPT7-SEPT9; SEPT4-SEPT6-SEPT7 and SEPT4-SEPT8-SEPT7), followed by comparative structural analysis. The cDNAs coding for the proteins SEPT9, SEPT6, SEPT2, SEPT11, SEPT8, SEPT4, SEPT9GCα0 (residues 262-568) and SEPT9GC (residues 279-568) were successfully cloned into transferable or expression vectors. The best characterized complex was that composed of SEPT2-SEPT6-SEPT7-SEPT9GCα0, which was confirmed by LC-MS/MS analysis after triptic digestion, unveiling the in vitro production of a tetrameric septin complex. Additionally, we characterized the hetero-dimer formed by SEPT7NGc-SEPT9GC. However, the most fully investigated proteins were the constructs SEPT9GCα0 and SEPT9GC which were studied individually for biophysical and structural characterizations. SEPT9GCα0 was highly unstable contrasting with SEPT9GC that was efficiently produced and characterized. The presence of the oligomeric state of SEPT9GC (monomer) was confirmed by molecular exclusion chromatography. The protein was produced in the apo form and was capable of hydrolyzing GTP. The affinity of SEPT9GC for GDP and GTPγS nucleotides was evaluated by Isothermal Titration Calorimetry (ITC) revealing that SEPT9GC has a higher affinity for GTPγS, with a Kd of 25.9 µM, which is dependent on the presence of Mg2+. Crystallization studies of this protein were performed, obtaining high quality crystals of protein complexes with GDP and GTPγS. Interestingly, the structure of the complex of SEPT9GC with the nucleotide GTPγS was obtained by soaking a previously grown crystal of the GDP complex. This is the first report of the application of this method for septins. Finally, we have obtained three sets of crystallographic data, two for SEPT9GC-GDP, at resolutions of 2.8 Å and 2.1 Å, and one set of data for SEPT9GC-GTPγS at 2.8 Å. Among the main characteristics observed in the SEPT9GC structure is the NC interface responsible for filament polymerization, which is shown to vary according to the type of bound nucleotide, with foreshortening of the filament in the presence of GTPγS. This indicates communication between consecutive G and NC interfaces along the filament. The conformational change at the interface involves the rearrangement of residues which are highly conserved in all septins as well as several which are SEPT9 group specific and may have implications for filament assembly and membrane association.

A Biologia de Sistemas proporciona um olhar holístico sobre os processos biológicos, integrando os diversos componentes intracelulares através de redes altamente complexas. Em particular, redes de co-expressão tem permitido nos últimos anos uma compreensão cada vez maior dos sistemas biológicos e dos mecanismos moleculares que os regem. Por outro lado, as ferramentas matemáticas e estatísticas já desenvolvidas para a análise destas redes e sistemas são, em geral, densas e pouco familiares para profissionais das áreas biológicas e da saúde. Portanto, a fim de possibilitar uma análise ao mesmo tempo relevante e facilitada, nosso grupo criou a ferramenta CEMiTool, que tem por objetivo identificar módulos de coexpressão de genes de modo automático, de maneira fácil e intuitiva para usuários com pouca ou nenhuma experiência com linguagens de programação. A fim de demonstrar a facilidade de uso da ferramenta, aplicamos o CEMiTool a mais de 1000 estudos de transcriptômica, cujos resultados foram utilizados para a confecção de um banco de dados, permitindo a integração de informações entre estudos. Além disso, para facilitar ainda mais o acesso a este tipo de análises, foi criada uma versão online da ferramenta, denominada webCEMiTool, que permite realizar as análises no navegador. Finalmente, criou-se também a ferramenta annotator, permitindo a definição automática de grupos de amostras de estudos de transcriptômica a partir do agrupamento de cadeias de caracteres presentes em dados de anotação. Todo o código está livremente disponível à comunidade. / System biology methods provide a holistic view of biological processes, integrating the several intracellular molecular components via the use of highly complex networks. In particular, co-expression networks have allowed for an increasing understanding of biological systems and the complex molecular mechanisms driving them. On the other hand, previously described tools for the analysis of biological networks are in general relatively difficult to use for life and health scientists given their high mathematical and computational demand. Therefore, in order to provide at the same time a relevant and easy-to-use analysis, we have developed the CEMiTool package, which aims to identify gene coexpression modules in an automatic, easy and intuitive way for users with little to no prior computational expertise. We applied CEMiTool to over 1000 transcriptomics studies and used the results to create a new gene coexpression database, which allows users to integrate information across analyses. Moreover, to further facilitate analyses we developed an online version of the tool named webCEMiTool, which permits users to run coexpression analysis easily via browser. Finally, we also developed annotator, a package for automatically determining experimental groups based on sample annotation string similarity. All code is freely available to the community.

The amount of intramuscular fat can influence the sensory characteristics and nutritional value of beef, thus the selection of animals with adequate fat content for consumer becomes important. Intramuscular fat is a complex trait that is difficult to measure and there is growing knowledge about the genes and pathways that control the biological processes involved in fat deposition in muscle. MicroRNAs (miRNAs) are well conserved class of non-coding small RNAs that modulate gene expression of a range of functions in animal development and physiology. This study aimed to identify differentially expressed (DE) miRNAs, regulatory candidate genes and co-expression networks using mRNAs and miRNAs expression data from the Longissimus dorsi muscle of 30 Nelore steers with extreme genomic estimated breeding values (GEBV) for intramuscular fat (IMF) content. The differential expression analysis between the miRNA data from animals with extreme GEBV values for IMF identified six DE miRNAs. Functional annotation of target genes for these microRNAs indicates that PPARs signaling pathway is involved with IMF deposition. Regulatory candidate genes such as SDHAF4, FBXO17, ALDOA and PKM were identified by partial correlation with information theory (PCIT), phenotypic impact factor (PIF) and regulatory impact factor (RIF) approaches from integrated miRNAs-mRNAs expression data. Two DE miRNAs, bta-miR-143 and bta-miR-146b, upregulated in Low IMF group, were also correlated with regulatory candidate genes, which were functionally enriched for GO terms for fatty acids oxidation. Co-expression networks identified several modules related to immune system, protein metabolism, energy metabolism and glucose catabolism by weighted correlation network analysis (WGCNA), which showed possible interaction and regulation between mRNAs and miRNAs. This study contributes to our understanding of regulatory mechanisms of gene signaling networks involved in fat deposition process. Glucose metabolism and inflammation process were the main pathways found in integrative mRNAs-miRNAs analysis and showed to influence intramuscular fat content in beef cattle. / A quantidade de gordura intramuscular pode influenciar as características sensoriais e o valor nutricional da carne bovina, assim, a seleção de animais com conteúdo de gordura adequado para o consumidor torna-se importante. A gordura intramuscular é uma característica complexa, de difícil medição e há um conhecimento crescente sobre os genes e vias que controlam os processos biológicos envolvidos na deposição de gordura no músculo. MicroRNAs (miRNAs) são uma classe bem conservados de pequenos RNAs não-codificantes, que modulam a expressão gênica de uma gama de funções no desenvolvimento e fisiologia animal. Este estudo objetivou identificar miRNAs diferencialmente expressos (DE), genes reguladores candidatos e redes de co-expressão usando dados de expressão de mRNAs e miRNAs do músculo Longissimus dorsi de 30 novilhos Nelore com valores genéticos genômicos estimados (GEBV) extremos para conteúdo de gordura intramuscular (IMF). A análise de expressão diferencial entre os dados de miRNA de animais com valores extremos de GEBV para o IMF identificou seis miRNAs DE. A anotação funcional de genes alvos destes microRNAs indica que a via de sinalização de PPAR está envolvida com a deposição de IMF. Os genes reguladores candidatos, tais como SDHAF4, FBXO17, ALDOA e PKM foram identificados pelas abordagens de correlação parcial com teoria da informação (PCIT), fator de impacto fenotípico (PIF) e fator de impacto regulatório (RIF) a partir de dados integrados de expressão de mRNAs-miRNAs. Dois miRNAs, bta-miR-143 e bta-miR-146b, com alta expressão no grupo de baixo conteúdo de IMF, também foram correlacionados com genes reguladores candidatos, os quais foram funcionalmente enriquecidos para termos GO relacionados a oxidação de ácidos graxos. As redes de co-expressão identificaram vários módulos relacionados ao sistema imunológico, ao metabolismo das proteínas, ao metabolismo energético e ao catabolismo da glicose através da análise ponderada da rede de correlação (WGCNA), que mostrou possível interação e regulação entre mRNAs e miRNAs. Este estudo contribui com a compreensão dos possíveis mecanismos reguladores das redes de sinalização genética envolvidas no processo de deposição de gordura. O metabolismo da glicose e o processo de inflamação foram as principais vias encontrados na análise integrada de mRNA-miRNA e mostraram estar associadas ao conteúdo de gordura intramuscular em bovinos de corte.

The amount of intramuscular fat can influence the sensory characteristics and nutritional value of beef, thus the selection of animals with adequate fat content for consumer becomes important. Intramuscular fat is a complex trait that is difficult to measure and there is growing knowledge about the genes and pathways that control the biological processes involved in fat deposition in muscle. MicroRNAs (miRNAs) are well conserved class of non-coding small RNAs that modulate gene expression of a range of functions in animal development and physiology. This study aimed to identify differentially expressed (DE) miRNAs, regulatory candidate genes and co-expression networks using mRNAs and miRNAs expression data from the Longissimus dorsi muscle of 30 Nelore steers with extreme genomic estimated breeding values (GEBV) for intramuscular fat (IMF) content. The differential expression analysis between the miRNA data from animals with extreme GEBV values for IMF identified six DE miRNAs. Functional annotation of target genes for these microRNAs indicates that PPARs signaling pathway is involved with IMF deposition. Regulatory candidate genes such as SDHAF4, FBXO17, ALDOA and PKM were identified by partial correlation with information theory (PCIT), phenotypic impact factor (PIF) and regulatory impact factor (RIF) approaches from integrated miRNAs-mRNAs expression data. Two DE miRNAs, bta-miR-143 and bta-miR-146b, upregulated in Low IMF group, were also correlated with regulatory candidate genes, which were functionally enriched for GO terms for fatty acids oxidation. Co-expression networks identified several modules related to immune system, protein metabolism, energy metabolism and glucose catabolism by weighted correlation network analysis (WGCNA), which showed possible interaction and regulation between mRNAs and miRNAs. This study contributes to our understanding of regulatory mechanisms of gene signaling networks involved in fat deposition process. Glucose metabolism and inflammation process were the main pathways found in integrative mRNAs-miRNAs analysis and showed to influence intramuscular fat content in beef cattle. / A quantidade de gordura intramuscular pode influenciar as características sensoriais e o valor nutricional da carne bovina, assim, a seleção de animais com conteúdo de gordura adequado para o consumidor torna-se importante. A gordura intramuscular é uma característica complexa, de difícil medição e há um conhecimento crescente sobre os genes e vias que controlam os processos biológicos envolvidos na deposição de gordura no músculo. MicroRNAs (miRNAs) são uma classe bem conservados de pequenos RNAs não-codificantes, que modulam a expressão gênica de uma gama de funções no desenvolvimento e fisiologia animal. Este estudo objetivou identificar miRNAs diferencialmente expressos (DE), genes reguladores candidatos e redes de co-expressão usando dados de expressão de mRNAs e miRNAs do músculo Longissimus dorsi de 30 novilhos Nelore com valores genéticos genômicos estimados (GEBV) extremos para conteúdo de gordura intramuscular (IMF). A análise de expressão diferencial entre os dados de miRNA de animais com valores extremos de GEBV para o IMF identificou seis miRNAs DE. A anotação funcional de genes alvos destes microRNAs indica que a via de sinalização de PPAR está envolvida com a deposição de IMF. Os genes reguladores candidatos, tais como SDHAF4, FBXO17, ALDOA e PKM foram identificados pelas abordagens de correlação parcial com teoria da informação (PCIT), fator de impacto fenotípico (PIF) e fator de impacto regulatório (RIF) a partir de dados integrados de expressão de mRNAs-miRNAs. Dois miRNAs, bta-miR-143 e bta-miR-146b, com alta expressão no grupo de baixo conteúdo de IMF, também foram correlacionados com genes reguladores candidatos, os quais foram funcionalmente enriquecidos para termos GO relacionados a oxidação de ácidos graxos. As redes de co-expressão identificaram vários módulos relacionados ao sistema imunológico, ao metabolismo das proteínas, ao metabolismo energético e ao catabolismo da glicose através da análise ponderada da rede de correlação (WGCNA), que mostrou possível interação e regulação entre mRNAs e miRNAs. Este estudo contribui com a compreensão dos possíveis mecanismos reguladores das redes de sinalização genética envolvidas no processo de deposição de gordura. O metabolismo da glicose e o processo de inflamação foram as principais vias encontrados na análise integrada de mRNA-miRNA e mostraram estar associadas ao conteúdo de gordura intramuscular em bovinos de corte.

A seleção de bovinos de corte para eficiência alimentar (EA) é bastante vantajosa não só do ponto de vista produtivo e econômico como também por ajudar a diminuir o impacto ambiental da produção pecuária. Por ser uma característica multifatorial e de mensuração onerosa, objetivou-se com esse trabalho, a partir da expressão gênica global hepática de animais com alta eficiência alimentar (AEA) e baixa eficiência alimentar (BEA), identificar novos genes, funções biológicas e genes reguladores associados a esse fenótipo. Para isso, 98 bovinos Nelore foram avaliados quanto ao desempenho em confinamento, medidas de EA, ultrassonografia de carcaça, bioquímica sérica, biometria, rendimento de carcaça, maciez de carne e avaliação de líquido ruminal. Além disso, 8 animais de AEA e 8 animais de BEA, selecionados pela medida de consumo e ganho residual ao final do confinamento, tiveram dados de perfil transcriptômico hepático analisados por 3 abordagens: expressão gênica diferencial, co-expressão e co-expressão diferencial. Foi observado que os grupos de AEA e BEA apresentaram desempenho igual quanto ao peso inicial e final, ganho de peso, rendimento de carcaça e área de olho de lombo. Por outro lado, os animais de BEA tiveram maior consumo de alimentos e maior deposição de gordura subcutânea e visceral. Além disso, os animais de BEA apresentaram níveis elevados de colesterol e de GGT e a análise de perfil transcriptômico mostrou estar relacionada à resposta imunológica, inflamação e metabolismo de lipídeos. Baseado nesses resultados e em pesquisas em humanos criou-se a hipótese de que os animais de BEA são mais susceptíveis a infecção bacteriana no fígado em resposta à mudança da dieta a pasto para a dieta de confinamento. / The selection of beef cattle to feed efficiency (FE) traits is very important not only from the productive and economic perspective but also for helping to reduce the environmental impact of livestock production. Being a multifactorial and expensive to measurement trait, the aim of this work was to analyze the liver global gene expression profile of animals with high feed efficiency (HFE) and low feed efficiency (LFE), to identify new genes, biological functions and regulatory genes associated to this phenotype. For this purpose, 98 Nellore cattle were evaluated regarding feedlot performance, FE measures, carcass ultrasound, serum biochemistry, biometric measures, carcass evaluation, meat tenderness and evaluation of ruminal fluid. In addition, 8 animals of HFE and 8 animals of LFE, selected by the measure of residual intake and body weight gain at the end of feeding trial, had liver transcriptomic profile data analyzed by three approaches: differential gene expression, co-expression and differential co-expression. It was observed that HFE and LFE groups showed equal performance for initial and final weight, weight gain, carcass yield and rib eye area. On the other hand, the animals of LFE had higher feed intake and increased deposition of subcutaneous and visceral fat. In addition, animals of LFE showed higher levels of cholesterol and GGT and transcriptomic profile analysis showed to be related to immune response, inflammation and lipid metabolism. Based on these results and research in humans we created the hypothesis that the LFE animals are more susceptible to bacterial infection in the liver in response to the change of pasture diet to feedlot diet.

A diversidade de interações que ocorre dentro de sistemas biológicos, considerando desde as organelas de uma célula até toda a biosfera, pode ser modelada por meio da teoria de redes. A dinâmica das interações entre os elementos é uma propriedade intrínseca desses sistemas. Diversas ferramentas foram propostas para comparar redes, que representam os muitos estados assumidos por um sistema. Porém, nenhuma delas é capaz de comparar características estruturais de mais de duas redes simultaneamente. Devido à grande quantidade de estados que um sistema pode assumir, construímos uma ferramenta estatística para comparar duas ou mais redes e indicar variáveis chave no processo estudado. A principal proposta deste trabalho foi comparar redes de correlação usando medidas baseadas nos espectros dos grafos (conjunto de autovalores das matrizes de adjacência), como a distribuição espectral. Essa medida está associada a diversas características estruturais das redes como o número de caminhos, diâmetro e cliques. Além da distribuição espectral, também comparamos as redes por entropia espectral, distribuição dos graus e pelas centralidades dos nós. Usamos dois diferentes conjuntos de dados biológicos (expressão gênica de células tumorais e metabolismo vegetal) para realizar os testes de desempenho da ferramenta e para os estudos de caso. O método proposto está implementado em um pacote do programa R, chamado BioNetStat, com interface gráfica para o usuário leigo em programação. Constatamos que os testes são eficientes em diferenciar mais de duas redes. Além disso, o aumento do número de redes comparadas e a queda dos números de unidades amostrais, diminui o poder estatístico do teste. Mostramos ainda que ocorre uma economia de tempo significativa ao realizarmos uma única análise para comparar muitas redes ao invés de compará-las par-a-par. Além disto, o método apontou grupos de variáveis com papel central nos sistemas biológicos estudados que não foram encontrados nas análises onde apenas a expressão ou concentração dos elementos foi estudada. Foi possível assim diferenciar células de tipos cancerígenos ou órgãos de organismos vegetais através das centralidades das redes. As variáveis levantadas possibilitam ao usuário gerar hipóteses sobre seus papeis nos processos em estudo. O BioNetStat pode assim ajudar a detectar possíveis novas descobertas associadas a mecanismos de funcionamento de sistemas. / The diversity of interactions, which are among elements of the biological systems, can be studied based on the networks theory. Moreover, the dynamic of these interactions is an inherent trait of those systems. In this sense, several tools have been proposed to compare networks, in that each network represents a state assumed by the system. However, the biological systems generally can assume much more than two biological states and none of the tools are able to compare structural characteristics among more than two networks simultaneously. To solve this issue, we developed a statistical tool to compare two or more networks and highlight key variables of a system. Here we describe the new method, called BioNetStat, that is able to compare correlation networks using traits that are based on graph spectra (the group of eigenvalues of the adjacency matrix), such as the spectral distribution. This measure is associated with several structural characteristics of networks such as the number of walks, diameter, and cliques. In addition to the spectral distribution, BioNetStat can also compare networks to the node centralities. We used two different biological datasets, tumoral cells genes expressions and plant metabolism, to evaluate the performance of BioNetStat and as case studies. The tool is implemented in an R package, and it also has a user-friendly interface. We showed that BioNetStat is efficient in distinguishing more than two networks. In comparison with a similar tool (GSCA), the increase in the number of compared networks reduces less the statistical power of the BioNetStat than the GSCA. Furthermore, BioNetStat is able to find signaling pathways in a bigger proportion than the GSCA, complementing tools proposed in the literature. In the case studies, the method pointed out variables, and sets of variables, with a central role in biological systems, which were not highlighted when only gene expression pattern or metabolomics were studied. For instance, BioNetStat allowed us to differentiate among cancer types and plant organs. The BioNetStat results bring new findings on what differentiate the states, giving us a systemic view of our study subject and affording the proposition of new hypotheses about the studied processes.