Eimeria tenella is a eukaryotic, intracellular parasite that, along with six other Eimeria species, causes coccidiosis in chickens. This disease can result in weight loss or even death and is estimated to cause 2 billion euros of damages to the chicken industry each year. While much is known of the life cycle of E. tenella in the chicken, less is known about molecular mechanisms of infection and the chicken immune response. In this study, we produced a pipeline for dual RNA-sequencing analysis of a mixed chicken and E. tenella dataset.  We then carried out an analysis on an in vitro infection of the chicken macrophage HD-11 cell line.  This was followed by a differential expression analysis across six time points, 2, 4, 12, 24, 48, and 72 hours post-infection, in order to elucidate these mechanisms. The results showed clear patterns of expression for the chicken immune genes, with strong down-regulation of genes across the immune system at 24 hours and a repetition of early patterns at 72 hours, indicating that reinfection by a second generation of parasite cells was occurring. Several genes that may have important roles in the immune reaction of the chicken were identified, such as MRC2, ITGB3 and ITGA9, along with genes with known roles, such as TLR15. The expression of surface antigen genes in E. tenella was also examined, showing a clear upregulation in the late stages of merogony, suggesting important roles for merozoites. Finally, a co-expression analysis was carried out, showing considerable co-expression among the two organisms.  One of the gene co-expression networks identified appeared to be enriched with both infection specific genes from E. tenella and chicken immune genes. These results, along with the pipeline, will be used in further studies on E. tenella infections and bring us closer to the eventual goal of a vaccine for coccidiosis.

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The amount of intramuscular fat can influence the sensory characteristics and nutritional value of beef, thus the selection of animals with adequate fat content for consumer becomes important. Intramuscular fat is a complex trait that is difficult to measure and there is growing knowledge about the genes and pathways that control the biological processes involved in fat deposition in muscle. MicroRNAs (miRNAs) are well conserved class of non-coding small RNAs that modulate gene expression of a range of functions in animal development and physiology. This study aimed to identify differentially expressed (DE) miRNAs, regulatory candidate genes and co-expression networks using mRNAs and miRNAs expression data from the Longissimus dorsi muscle of 30 Nelore steers with extreme genomic estimated breeding values (GEBV) for intramuscular fat (IMF) content. The differential expression analysis between the miRNA data from animals with extreme GEBV values for IMF identified six DE miRNAs. Functional annotation of target genes for these microRNAs indicates that PPARs signaling pathway is involved with IMF deposition. Regulatory candidate genes such as SDHAF4, FBXO17, ALDOA and PKM were identified by partial correlation with information theory (PCIT), phenotypic impact factor (PIF) and regulatory impact factor (RIF) approaches from integrated miRNAs-mRNAs expression data. Two DE miRNAs, bta-miR-143 and bta-miR-146b, upregulated in Low IMF group, were also correlated with regulatory candidate genes, which were functionally enriched for GO terms for fatty acids oxidation. Co-expression networks identified several modules related to immune system, protein metabolism, energy metabolism and glucose catabolism by weighted correlation network analysis (WGCNA), which showed possible interaction and regulation between mRNAs and miRNAs. This study contributes to our understanding of regulatory mechanisms of gene signaling networks involved in fat deposition process. Glucose metabolism and inflammation process were the main pathways found in integrative mRNAs-miRNAs analysis and showed to influence intramuscular fat content in beef cattle. / A quantidade de gordura intramuscular pode influenciar as características sensoriais e o valor nutricional da carne bovina, assim, a seleção de animais com conteúdo de gordura adequado para o consumidor torna-se importante. A gordura intramuscular é uma característica complexa, de difícil medição e há um conhecimento crescente sobre os genes e vias que controlam os processos biológicos envolvidos na deposição de gordura no músculo. MicroRNAs (miRNAs) são uma classe bem conservados de pequenos RNAs não-codificantes, que modulam a expressão gênica de uma gama de funções no desenvolvimento e fisiologia animal. Este estudo objetivou identificar miRNAs diferencialmente expressos (DE), genes reguladores candidatos e redes de co-expressão usando dados de expressão de mRNAs e miRNAs do músculo Longissimus dorsi de 30 novilhos Nelore com valores genéticos genômicos estimados (GEBV) extremos para conteúdo de gordura intramuscular (IMF). A análise de expressão diferencial entre os dados de miRNA de animais com valores extremos de GEBV para o IMF identificou seis miRNAs DE. A anotação funcional de genes alvos destes microRNAs indica que a via de sinalização de PPAR está envolvida com a deposição de IMF. Os genes reguladores candidatos, tais como SDHAF4, FBXO17, ALDOA e PKM foram identificados pelas abordagens de correlação parcial com teoria da informação (PCIT), fator de impacto fenotípico (PIF) e fator de impacto regulatório (RIF) a partir de dados integrados de expressão de mRNAs-miRNAs. Dois miRNAs, bta-miR-143 e bta-miR-146b, com alta expressão no grupo de baixo conteúdo de IMF, também foram correlacionados com genes reguladores candidatos, os quais foram funcionalmente enriquecidos para termos GO relacionados a oxidação de ácidos graxos. As redes de co-expressão identificaram vários módulos relacionados ao sistema imunológico, ao metabolismo das proteínas, ao metabolismo energético e ao catabolismo da glicose através da análise ponderada da rede de correlação (WGCNA), que mostrou possível interação e regulação entre mRNAs e miRNAs. Este estudo contribui com a compreensão dos possíveis mecanismos reguladores das redes de sinalização genética envolvidas no processo de deposição de gordura. O metabolismo da glicose e o processo de inflamação foram as principais vias encontrados na análise integrada de mRNA-miRNA e mostraram estar associadas ao conteúdo de gordura intramuscular em bovinos de corte.

The amount of intramuscular fat can influence the sensory characteristics and nutritional value of beef, thus the selection of animals with adequate fat content for consumer becomes important. Intramuscular fat is a complex trait that is difficult to measure and there is growing knowledge about the genes and pathways that control the biological processes involved in fat deposition in muscle. MicroRNAs (miRNAs) are well conserved class of non-coding small RNAs that modulate gene expression of a range of functions in animal development and physiology. This study aimed to identify differentially expressed (DE) miRNAs, regulatory candidate genes and co-expression networks using mRNAs and miRNAs expression data from the Longissimus dorsi muscle of 30 Nelore steers with extreme genomic estimated breeding values (GEBV) for intramuscular fat (IMF) content. The differential expression analysis between the miRNA data from animals with extreme GEBV values for IMF identified six DE miRNAs. Functional annotation of target genes for these microRNAs indicates that PPARs signaling pathway is involved with IMF deposition. Regulatory candidate genes such as SDHAF4, FBXO17, ALDOA and PKM were identified by partial correlation with information theory (PCIT), phenotypic impact factor (PIF) and regulatory impact factor (RIF) approaches from integrated miRNAs-mRNAs expression data. Two DE miRNAs, bta-miR-143 and bta-miR-146b, upregulated in Low IMF group, were also correlated with regulatory candidate genes, which were functionally enriched for GO terms for fatty acids oxidation. Co-expression networks identified several modules related to immune system, protein metabolism, energy metabolism and glucose catabolism by weighted correlation network analysis (WGCNA), which showed possible interaction and regulation between mRNAs and miRNAs. This study contributes to our understanding of regulatory mechanisms of gene signaling networks involved in fat deposition process. Glucose metabolism and inflammation process were the main pathways found in integrative mRNAs-miRNAs analysis and showed to influence intramuscular fat content in beef cattle. / A quantidade de gordura intramuscular pode influenciar as características sensoriais e o valor nutricional da carne bovina, assim, a seleção de animais com conteúdo de gordura adequado para o consumidor torna-se importante. A gordura intramuscular é uma característica complexa, de difícil medição e há um conhecimento crescente sobre os genes e vias que controlam os processos biológicos envolvidos na deposição de gordura no músculo. MicroRNAs (miRNAs) são uma classe bem conservados de pequenos RNAs não-codificantes, que modulam a expressão gênica de uma gama de funções no desenvolvimento e fisiologia animal. Este estudo objetivou identificar miRNAs diferencialmente expressos (DE), genes reguladores candidatos e redes de co-expressão usando dados de expressão de mRNAs e miRNAs do músculo Longissimus dorsi de 30 novilhos Nelore com valores genéticos genômicos estimados (GEBV) extremos para conteúdo de gordura intramuscular (IMF). A análise de expressão diferencial entre os dados de miRNA de animais com valores extremos de GEBV para o IMF identificou seis miRNAs DE. A anotação funcional de genes alvos destes microRNAs indica que a via de sinalização de PPAR está envolvida com a deposição de IMF. Os genes reguladores candidatos, tais como SDHAF4, FBXO17, ALDOA e PKM foram identificados pelas abordagens de correlação parcial com teoria da informação (PCIT), fator de impacto fenotípico (PIF) e fator de impacto regulatório (RIF) a partir de dados integrados de expressão de mRNAs-miRNAs. Dois miRNAs, bta-miR-143 e bta-miR-146b, com alta expressão no grupo de baixo conteúdo de IMF, também foram correlacionados com genes reguladores candidatos, os quais foram funcionalmente enriquecidos para termos GO relacionados a oxidação de ácidos graxos. As redes de co-expressão identificaram vários módulos relacionados ao sistema imunológico, ao metabolismo das proteínas, ao metabolismo energético e ao catabolismo da glicose através da análise ponderada da rede de correlação (WGCNA), que mostrou possível interação e regulação entre mRNAs e miRNAs. Este estudo contribui com a compreensão dos possíveis mecanismos reguladores das redes de sinalização genética envolvidas no processo de deposição de gordura. O metabolismo da glicose e o processo de inflamação foram as principais vias encontrados na análise integrada de mRNA-miRNA e mostraram estar associadas ao conteúdo de gordura intramuscular em bovinos de corte.

Uma das principais áreas de pesquisa em Biologia de Sistemas refere-se à descoberta de redes biológicas a partir de conjuntos de dados de microarrays. Estas redes consistem de um grande número de genes cujos níveis de expressão afetam os outros genes de vários modos. Nesta tese, apresenta-se uma nova maneira de analisar os conjuntos de dados de microarrays, com base nos diferentes tipos de ciclos encontrados entre os genes das redes de co-expressão construídas com dados quantificados obtidos a partir dos microarrays. A entrada do método de análise é formada pelos dados brutos, um conjunto de genes de interesse (por exemplo, genes de uma via conhecida) e uma função (ativador ou inibidor) destes genes. A saída do método é um conjunto de ciclos. Um ciclo é um caminho fechado com todos os vértices (exceto o primeiro e o último) distintos. Graças à nova forma de encontrar relações entre os genes, é possível uma interpretação mais robusta das correlações dos genes, porque os ciclos estão associados a mecanismos de feedback, que são muito comuns em redes biológicas. A hipótese é que feedbacks negativos permitem encontrar relações entre os genes que podem ajudar a explicar a estabilidade do processo regulatório dentro da célula. Ciclos de feedback positivo, por outro lado, podem mostrar a quantidade de desequilíbrio de uma determinada célula em um determinado momento. A análise baseada em ciclos permite identificar a relação estequiométrica entre os genes da rede. Esta metodologia proporciona uma melhor compreensão da biologia do tumor. Portanto, as principais contribuições desta tese são: (i) um novo método de análise baseada em ciclos; (ii) um novo método de classificação; (iii) e, finalmente, aplicação dos métodos e a obtenção de resultados práticos. A metodologia proposta foi utilizada para analisar os genes de quatro redes fortemente relacionadas com o câncer - apoptose, glicólise, ciclo celular e NF B - em tecidos do tipo mais agressivo de tumor cerebral (Gliobastoma multiforme - GBM) e em tecidos cerebrais saudáveis. A maioria dos pacientes com GBM morrem em menos de um ano, essencialmente nenhum paciente tem sobrevivência a longo prazo, por isso estes tumores têm atraído atenção significativa. Os principais resultados nesta tese mostram que a relação estequiométrica entre genes envolvidos na apoptose, glicólise, ciclo celular e NF B está desequilibrada em amostras de GBM em comparação as amostras de controle. Este desequilíbrio pode ser medido e explicado pela identificação de um percentual maior de ciclos positivos nas redes das primeiras amostras. Esta conclusão ajuda a entender mais sobre a biologia deste tipo de tumor. O método de classificação baseado no ciclo proposto obteve as mesmas métricas de desempenho como uma rede neural, um método clássico de classificação. No entanto, o método proposto tem uma vantagem significativa em relação às redes neurais. O método de classificação proposto não só classifica as amostras, fornecendo diagnóstico, mas também explica porque as amostras foram classificadas de uma certa maneira em termos dos mecanismos de feedback que estão presentes/ausentes. Desta forma, o método fornece dicas para bioquímicos sobre possíveis experiências laboratoriais, bem como sobre potenciais genes alvo de terapias. / One of the main research areas in Systems Biology concerns the discovery of biological networks from microarray datasets. These networks consist of a great number of genes whose expression levels affect each other in various ways. We present a new way of analyzing microarray datasets, based on the different kind of cycles found among genes of the co-expression networks constructed using quantized data obtained from the microarrays. The input of the analysis method is formed by raw data, a set of interest genes (for example, genes from a known pathway) and a function (activator or inhibitor) of these genes. The output of the method is a set of cycles. A cycle is a closed walk, in which all vertices (except the first and last) are distinct. Thanks to the new way of finding relations among genes, a more robust interpretation of gene correlations is possible, because cycles are associated with feedback mechanisms that are very common in biological networks. Our hypothesis is that negative feedbacks allow finding relations among genes that may help explaining the stability of the regulatory process within the cell. Positive feedback cycles, on the other hand, may show the amount of imbalance of a certain cell in a given time. The cycle-based analysis allows identifying the stoichiometric relationship between the genes of the network. This methodology provides a better understanding of the biology of tumors. As a consequence, it may enable the development of more effective treatment therapies. Furthermore, cycles help differentiate, measure and explain the phenomena identified in healthy and diseased tissues. Cycles may also be used as a new method for classification of samples of a microarray (cancer diagnosis). Compared to other classification methods, cycle-based classification provides a richer explanation of the proposed classification, that can give hints on the possible therapies. Therefore, the main contributions of this thesis are: (i) a new cycle-based analysis method; (ii) a new microarray samples classification method; (iii) and, finally, application and achievement of practical results. We use the proposed methodology to analyze the genes of four networks closely related with cancer - apoptosis, glucolysis, cell cycle and NF B - in tissues of the most aggressive type of brain tumor (Gliobastoma multiforme – GBM) and in healthy tissues. Because most patients with GBMs die in less than a year, and essentially no patient has long-term survival, these tumors have drawn significant attention. Our main results show that the stoichiometric relationship between genes involved in apoptosis, glucolysis, cell cycle and NF B pathways is unbalanced in GBM samples versus control samples. This dysregulation can be measured and explained by the identification of a higher percentage of positive cycles in these networks. This conclusion helps to understand more about the biology of this tumor type. The proposed cycle-based classification method achieved the same performance metrics as a neural network, a classical classification method. However, our method has a significant advantage with respect to neural networks. The proposed classification method not only classifies samples, providing diagnosis, but also explains why samples were classified in a certain way in terms of the feedback mechanisms that are present/absent. This way, the method provides hints to biochemists about possible laboratory experiments, as well as on potential drug target genes.

Uma das principais áreas de pesquisa em Biologia de Sistemas refere-se à descoberta de redes biológicas a partir de conjuntos de dados de microarrays. Estas redes consistem de um grande número de genes cujos níveis de expressão afetam os outros genes de vários modos. Nesta tese, apresenta-se uma nova maneira de analisar os conjuntos de dados de microarrays, com base nos diferentes tipos de ciclos encontrados entre os genes das redes de co-expressão construídas com dados quantificados obtidos a partir dos microarrays. A entrada do método de análise é formada pelos dados brutos, um conjunto de genes de interesse (por exemplo, genes de uma via conhecida) e uma função (ativador ou inibidor) destes genes. A saída do método é um conjunto de ciclos. Um ciclo é um caminho fechado com todos os vértices (exceto o primeiro e o último) distintos. Graças à nova forma de encontrar relações entre os genes, é possível uma interpretação mais robusta das correlações dos genes, porque os ciclos estão associados a mecanismos de feedback, que são muito comuns em redes biológicas. A hipótese é que feedbacks negativos permitem encontrar relações entre os genes que podem ajudar a explicar a estabilidade do processo regulatório dentro da célula. Ciclos de feedback positivo, por outro lado, podem mostrar a quantidade de desequilíbrio de uma determinada célula em um determinado momento. A análise baseada em ciclos permite identificar a relação estequiométrica entre os genes da rede. Esta metodologia proporciona uma melhor compreensão da biologia do tumor. Portanto, as principais contribuições desta tese são: (i) um novo método de análise baseada em ciclos; (ii) um novo método de classificação; (iii) e, finalmente, aplicação dos métodos e a obtenção de resultados práticos. A metodologia proposta foi utilizada para analisar os genes de quatro redes fortemente relacionadas com o câncer - apoptose, glicólise, ciclo celular e NF B - em tecidos do tipo mais agressivo de tumor cerebral (Gliobastoma multiforme - GBM) e em tecidos cerebrais saudáveis. A maioria dos pacientes com GBM morrem em menos de um ano, essencialmente nenhum paciente tem sobrevivência a longo prazo, por isso estes tumores têm atraído atenção significativa. Os principais resultados nesta tese mostram que a relação estequiométrica entre genes envolvidos na apoptose, glicólise, ciclo celular e NF B está desequilibrada em amostras de GBM em comparação as amostras de controle. Este desequilíbrio pode ser medido e explicado pela identificação de um percentual maior de ciclos positivos nas redes das primeiras amostras. Esta conclusão ajuda a entender mais sobre a biologia deste tipo de tumor. O método de classificação baseado no ciclo proposto obteve as mesmas métricas de desempenho como uma rede neural, um método clássico de classificação. No entanto, o método proposto tem uma vantagem significativa em relação às redes neurais. O método de classificação proposto não só classifica as amostras, fornecendo diagnóstico, mas também explica porque as amostras foram classificadas de uma certa maneira em termos dos mecanismos de feedback que estão presentes/ausentes. Desta forma, o método fornece dicas para bioquímicos sobre possíveis experiências laboratoriais, bem como sobre potenciais genes alvo de terapias. / One of the main research areas in Systems Biology concerns the discovery of biological networks from microarray datasets. These networks consist of a great number of genes whose expression levels affect each other in various ways. We present a new way of analyzing microarray datasets, based on the different kind of cycles found among genes of the co-expression networks constructed using quantized data obtained from the microarrays. The input of the analysis method is formed by raw data, a set of interest genes (for example, genes from a known pathway) and a function (activator or inhibitor) of these genes. The output of the method is a set of cycles. A cycle is a closed walk, in which all vertices (except the first and last) are distinct. Thanks to the new way of finding relations among genes, a more robust interpretation of gene correlations is possible, because cycles are associated with feedback mechanisms that are very common in biological networks. Our hypothesis is that negative feedbacks allow finding relations among genes that may help explaining the stability of the regulatory process within the cell. Positive feedback cycles, on the other hand, may show the amount of imbalance of a certain cell in a given time. The cycle-based analysis allows identifying the stoichiometric relationship between the genes of the network. This methodology provides a better understanding of the biology of tumors. As a consequence, it may enable the development of more effective treatment therapies. Furthermore, cycles help differentiate, measure and explain the phenomena identified in healthy and diseased tissues. Cycles may also be used as a new method for classification of samples of a microarray (cancer diagnosis). Compared to other classification methods, cycle-based classification provides a richer explanation of the proposed classification, that can give hints on the possible therapies. Therefore, the main contributions of this thesis are: (i) a new cycle-based analysis method; (ii) a new microarray samples classification method; (iii) and, finally, application and achievement of practical results. We use the proposed methodology to analyze the genes of four networks closely related with cancer - apoptosis, glucolysis, cell cycle and NF B - in tissues of the most aggressive type of brain tumor (Gliobastoma multiforme – GBM) and in healthy tissues. Because most patients with GBMs die in less than a year, and essentially no patient has long-term survival, these tumors have drawn significant attention. Our main results show that the stoichiometric relationship between genes involved in apoptosis, glucolysis, cell cycle and NF B pathways is unbalanced in GBM samples versus control samples. This dysregulation can be measured and explained by the identification of a higher percentage of positive cycles in these networks. This conclusion helps to understand more about the biology of this tumor type. The proposed cycle-based classification method achieved the same performance metrics as a neural network, a classical classification method. However, our method has a significant advantage with respect to neural networks. The proposed classification method not only classifies samples, providing diagnosis, but also explains why samples were classified in a certain way in terms of the feedback mechanisms that are present/absent. This way, the method provides hints to biochemists about possible laboratory experiments, as well as on potential drug target genes.

Uma das principais áreas de pesquisa em Biologia de Sistemas refere-se à descoberta de redes biológicas a partir de conjuntos de dados de microarrays. Estas redes consistem de um grande número de genes cujos níveis de expressão afetam os outros genes de vários modos. Nesta tese, apresenta-se uma nova maneira de analisar os conjuntos de dados de microarrays, com base nos diferentes tipos de ciclos encontrados entre os genes das redes de co-expressão construídas com dados quantificados obtidos a partir dos microarrays. A entrada do método de análise é formada pelos dados brutos, um conjunto de genes de interesse (por exemplo, genes de uma via conhecida) e uma função (ativador ou inibidor) destes genes. A saída do método é um conjunto de ciclos. Um ciclo é um caminho fechado com todos os vértices (exceto o primeiro e o último) distintos. Graças à nova forma de encontrar relações entre os genes, é possível uma interpretação mais robusta das correlações dos genes, porque os ciclos estão associados a mecanismos de feedback, que são muito comuns em redes biológicas. A hipótese é que feedbacks negativos permitem encontrar relações entre os genes que podem ajudar a explicar a estabilidade do processo regulatório dentro da célula. Ciclos de feedback positivo, por outro lado, podem mostrar a quantidade de desequilíbrio de uma determinada célula em um determinado momento. A análise baseada em ciclos permite identificar a relação estequiométrica entre os genes da rede. Esta metodologia proporciona uma melhor compreensão da biologia do tumor. Portanto, as principais contribuições desta tese são: (i) um novo método de análise baseada em ciclos; (ii) um novo método de classificação; (iii) e, finalmente, aplicação dos métodos e a obtenção de resultados práticos. A metodologia proposta foi utilizada para analisar os genes de quatro redes fortemente relacionadas com o câncer - apoptose, glicólise, ciclo celular e NF B - em tecidos do tipo mais agressivo de tumor cerebral (Gliobastoma multiforme - GBM) e em tecidos cerebrais saudáveis. A maioria dos pacientes com GBM morrem em menos de um ano, essencialmente nenhum paciente tem sobrevivência a longo prazo, por isso estes tumores têm atraído atenção significativa. Os principais resultados nesta tese mostram que a relação estequiométrica entre genes envolvidos na apoptose, glicólise, ciclo celular e NF B está desequilibrada em amostras de GBM em comparação as amostras de controle. Este desequilíbrio pode ser medido e explicado pela identificação de um percentual maior de ciclos positivos nas redes das primeiras amostras. Esta conclusão ajuda a entender mais sobre a biologia deste tipo de tumor. O método de classificação baseado no ciclo proposto obteve as mesmas métricas de desempenho como uma rede neural, um método clássico de classificação. No entanto, o método proposto tem uma vantagem significativa em relação às redes neurais. O método de classificação proposto não só classifica as amostras, fornecendo diagnóstico, mas também explica porque as amostras foram classificadas de uma certa maneira em termos dos mecanismos de feedback que estão presentes/ausentes. Desta forma, o método fornece dicas para bioquímicos sobre possíveis experiências laboratoriais, bem como sobre potenciais genes alvo de terapias. / One of the main research areas in Systems Biology concerns the discovery of biological networks from microarray datasets. These networks consist of a great number of genes whose expression levels affect each other in various ways. We present a new way of analyzing microarray datasets, based on the different kind of cycles found among genes of the co-expression networks constructed using quantized data obtained from the microarrays. The input of the analysis method is formed by raw data, a set of interest genes (for example, genes from a known pathway) and a function (activator or inhibitor) of these genes. The output of the method is a set of cycles. A cycle is a closed walk, in which all vertices (except the first and last) are distinct. Thanks to the new way of finding relations among genes, a more robust interpretation of gene correlations is possible, because cycles are associated with feedback mechanisms that are very common in biological networks. Our hypothesis is that negative feedbacks allow finding relations among genes that may help explaining the stability of the regulatory process within the cell. Positive feedback cycles, on the other hand, may show the amount of imbalance of a certain cell in a given time. The cycle-based analysis allows identifying the stoichiometric relationship between the genes of the network. This methodology provides a better understanding of the biology of tumors. As a consequence, it may enable the development of more effective treatment therapies. Furthermore, cycles help differentiate, measure and explain the phenomena identified in healthy and diseased tissues. Cycles may also be used as a new method for classification of samples of a microarray (cancer diagnosis). Compared to other classification methods, cycle-based classification provides a richer explanation of the proposed classification, that can give hints on the possible therapies. Therefore, the main contributions of this thesis are: (i) a new cycle-based analysis method; (ii) a new microarray samples classification method; (iii) and, finally, application and achievement of practical results. We use the proposed methodology to analyze the genes of four networks closely related with cancer - apoptosis, glucolysis, cell cycle and NF B - in tissues of the most aggressive type of brain tumor (Gliobastoma multiforme – GBM) and in healthy tissues. Because most patients with GBMs die in less than a year, and essentially no patient has long-term survival, these tumors have drawn significant attention. Our main results show that the stoichiometric relationship between genes involved in apoptosis, glucolysis, cell cycle and NF B pathways is unbalanced in GBM samples versus control samples. This dysregulation can be measured and explained by the identification of a higher percentage of positive cycles in these networks. This conclusion helps to understand more about the biology of this tumor type. The proposed cycle-based classification method achieved the same performance metrics as a neural network, a classical classification method. However, our method has a significant advantage with respect to neural networks. The proposed classification method not only classifies samples, providing diagnosis, but also explains why samples were classified in a certain way in terms of the feedback mechanisms that are present/absent. This way, the method provides hints to biochemists about possible laboratory experiments, as well as on potential drug target genes.

Network analyses, such as gene co-expression networks are an important approach for the systems-level study of biological data. For example, understanding patterns of \linebreak co-regulation in mental disorders can contribute to the development of new therapies and treatments. In a gene regulatory process a particular TF or ncRNA can up- or down-regulate other genes, therefore it is important to explicitly consider both positive and negative interactions. Although exists a variety of software and libraries for constructing and investigating such networks, none considers the sign of interaction. It is also required that the represented networks have high accuracy, where the interactions found have to be relevant and not found by chance or background noise. Another issue derived from building co-expression networks is the reproducibility of those. When constructing independent networks for the same phenotype, though, using different expression datasets, the output network can be remarkably distinct due to biological or technical noise in the data. However, most of the times the interest is not only to characterise a network but to compare its features to others. A series of questions arise from understanding phenotypes using co-expression networks: i) how to construct highly accurate networks; ii) how to combine multiple networks derived from different platforms; iii) how to compare multiple networks. For answering those questions, i) I improved the wTO method to construct highly accurate networks, where now each interaction in a network receives a probability. This method showed to be much more efficient in finding correct interactions than other well-known methods; ii) I developed a method that is able to combine multiple networks into one building a CN. This method enables the correction for background noise; iii) I developed a completely novel method for the comparison of multiple co-expression networks, CoDiNA. This method identifies genes specific to at least one network. It is natural that after associating genes to phenotypes, an inference whether those genes are enriched for a particular disorder is needed. I also present here a tool, RichR, that enables enrichment analysis and background correction. I applied the methods proposed here in two important studies. In the first one, the aim was to understand the neurogenesis process and how certain genes would affect it. The combination of the methods shown here pointed one particular TF, ZN787, as playing an important role in this process. Moreover, the application of this toolset to networks derived from brain samples of individuals with cognitive disorders identified genes and network connections that are specific to certain disorders, but also found an overlap between neurodegenerative disorders and brain development and between evolutionary changes and psychological disorders. CoDiNA also pointed out that there are genes involved in those disorders that are not only human-specific.

[ES] Las proteínas DELLA son elementos centrales de la ruta de señalización por giberelinas (GAs), donde actúan como represores de las respuestas a GAs. En angiospermas, se ha observado que las DELLAs interaccionan con cientos de factores de transcripción y otros reguladores transcripcionales, modulando de este modo la expresión génica. Por lo tanto, la participación generalizada de las GAs a lo largo del ciclo vital de las plantas es una consecuencia directa de la promiscuidad de las proteínas DELLA y de su rol como reguladores transcripcionales clave. Aunque las DELLAs se encuentran en todas las plantas terrestres, solo son reguladas por GAs en traqueofitas, en las cuales se han centrado la mayoría de los estudios previos. El trabajo aquí presentado pretende descifrar en qué punto de la evolución las DELLAs adquirieron las características moleculares que las convierten en "hubs", y qué ventajas biológicas podrían estar relacionadas con la evolución de las DELLAs. En el primer capítulo, describimos análisis comparativos de redes de co-expresión génicas asociadas a DELLA en especies vasculares y no vasculares, y proponemos que las DELLAs tienen un papel crítico en la conformación de panoramas transcripcionales. Desde su aparición en el ancestro de las plantas terrestres, conectaron múltiples programas transcripcionales que serían independientes sin ellas, mejoraron la eficiencia de la transmisión de información y aumentaron el nivel de complejidad en la regulación transcripcional. También observamos que este efecto se incrementó tras su integración en la señalización por GAs. En el segundo capítulo, proporcionamos pruebas experimentales más sólidas que extienden esta conclusión. Usando una combinación de rastreos de doble híbrido en levadura dirigidos, con DELLAs de diferentes posiciones en el linaje vegetal, y complementación heteróloga en plantas de Arabidopsis y Marchantia, mostramos que la promiscuidad es una característica conservada en todas las proteínas DELLA examinadas; lo cual sugiere que esta propiedad puede haber estado codificada en la DELLA ancestral, y después se mantuvo a lo largo de la evolución, con episodios de co-evolución entre las DELLAs y sus interactores. Finalmente, la comparación de dianas transcripcionales de las DELLAs en diferentes especies muestra la llamativa conservación de un pequeño conjunto de funciones reguladas por DELLAs en plantas vasculares y no vasculares -incluyendo la respuesta a factores de estrés-, mientras que análisis comparativos de promotores indican que las dianas específicas de cada especie aparecen mediante al menos dos mecanismos: el establecimiento de nuevas interacciones de la DELLA, y el acceso a nuevos promotores diana a través de interactores conservados. En resumen, proponemos que las DELLAs son proteínas intrínsecamente promiscuas, con propiedades de "hub" en virtualmente todas las plantas, y la conservación de sus dianas transcripcionales depende en gran medida de la evolución de sus interactores. La conservación de las propiedades de "hub" de las proteínas DELLA las convierte en dianas biotecnológicas ideales, ya que la mayoría del conocimiento generado en una especie podría ser fácilmente adaptado a otras especies relativamente lejanas. / [CA] Les proteïnes DELLA són elements centrals de la ruta de senyalització per gibberel·lines (GAs), on actuen com a repressors de les respostes a GAs. En angiospermes, s'ha observat que les DELLAs interaccionen amb centenars de factors de transcripció i altres reguladors transcripcionals, modulant d'aquesta manera l'expressió gènica. Per tant, la participació generalitzada de les GAs al llarg del cicle vital de les plantes és una conseqüència directa de la promiscuïtat de les proteïnes DELLA i del seu rol com a reguladors transcripcionals clau. Tot i que les DELLAs es troben en totes les plantes terrestres, només són regulades per GAs en traqueofites, en les quals s'han centrat la majoria dels estudis anteriors. El treball ací presentat pretén desxifrar en quin punt de l'evolució les DELLAs van adquirir les característiques moleculars que les converteixen en "hubs", i quins avantatges biològics podrien estar relacionats amb l'evolució de les DELLAs. En el primer capítol, descrivim anàlisis comparatius de xarxes de co-expressió gèniques associades a DELLA en espècies vasculars i no vasculars, i proposem que les DELLAs tenen un paper crític en la conformació de panorames transcripcionals. Des de la seua aparició en l'ancestre de les plantes terrestres, van connectar múltiples programes transcripcionals que serien independents sense elles, van millorar l'eficiència de la transmissió d'informació i augmentar el nivell de complexitat en la regulació transcripcional. També observem que aquest efecte es va incrementar després de la seua integració en la senyalització per GAs. En el segon capítol, proporcionem proves experimentals més sòlides que estenen aquesta conclusió. Usant una combinació de rastrejos de doble híbrid en rent dirigits, amb DELLAs de diferents posicions en el llinatge vegetal, i complementació heteròloga en plantes d'Arabidopsis i Marchantia, vam mostrar que la promiscuïtat és una característica conservada en totes les proteïnes DELLA examinades; la qual cosa suggereix que aquesta propietat pot haver estat codificada en la DELLA ancestral, i després es va mantenir al llarg de l'evolució, amb episodis de co-evolució entre les DELLAs i els seus interactors. Finalment, la comparació de dianes transcripcionals de les DELLAs en diferents espècies mostra la cridanera conservació d'un petit conjunt de funcions regulades per DELLAs en plantes vasculars i no vasculars -incloent la resposta a factors de estrès-, mentre que anàlisis comparatius de promotors indiquen que les dianes específiques de cada espècie apareixen mitjançant al menys dos mecanismes: l'establiment de noves interaccions de la DELLA, i l'accés a nous promotors diana a través d'interactors conservats. En resum, proposem que les DELLAs són proteïnes intrínsecament promíscues, amb propietats de "hub" en virtualment totes les plantes, i la conservació de les seues dianes transcripcionals depèn en gran mesura de l'evolució dels seus interactors. La conservació de les propietats de "hub" de les proteïnes DELLA les converteix en dianes biotecnològiques ideals, ja que la majoria del coneixement generat en una espècie podria ser fàcilment adaptat a altres espècies relativament llunyanes. / [EN] DELLA proteins are central elements of the gibberellin (GA) signaling pathway, where they act as repressors of GA responses. In angiosperms, DELLAs have been shown to interact with hundreds of transcription factors and other transcriptional regulators, thereby modulating gene expression. Hence, the widespread involvement of GAs along the plant life cycle is a direct consequence of the promiscuity of DELLA proteins and their role as key transcriptional regulators. Although DELLAs can be found in all land plants, they are only regulated by GAs in tracheophytes, where most of the previous studies have been focused. The work presented here aims to decipher at which point in evolution did DELLAs acquired the molecular features that render them as 'hubs', and what biological advantages could be related with DELLA evolution. In the first chapter, we describe comparative analyses of DELLA-associated gene co-expression networks in vascular and non-vascular species and propose that DELLAs have a critical role in the conformation of transcriptional landscapes. Upon their emergence in the ancestor of land plants, they connected multiple transcriptional programs that would be independent without them, improved the efficiency of information transmission and increased the level of complexity in transcriptional regulation. We also observed that this effect was enhanced after their integration in GA signaling. In the second chapter, we provide stronger experimental evidence that extends this conclusion. Using a combination of targeted yeast two-hybrid screenings with DELLAs from different positions in the plant lineage, and heterologous complementation in Arabidopsis and Marchantia plants, we show that promiscuity is a conserved feature in all the examined DELLA proteins, which suggests that this property might have been encoded in the ancestral DELLA, and then maintained along evolution, with episodes of co-evolution between DELLAs and their partners. Finally, comparison of DELLA transcriptional targets in different species shows a striking conservation of a small set of functions regulated by DELLAs in vascular and non-vascular plants -including the response to stress factors-, while comparative promoter analysis indicates that species-specific DELLA targets emerge through at least two mechanisms: establishment of novel DELLA interactions, and the access by conserved partners to new target promoters. In summary, we propose that DELLAs are intrinsically promiscuous proteins, with hub properties in virtually all land plants, and the conservation of their transcriptional targets largely depends on the evolution of their interactors. The conservation of the hub properties of DELLA proteins makes them ideal biotechnological targets, as most of the knowledge generated in one species could be readily adapted to other relatively distant species. / Esta tesis doctoral ha sido posible gracias a un contrato predoctoral FPU del Ministerio de Educación (FPU2014-01941). / Briones Moreno, A. (2020). Evolution of DELLA proteins as transcriptional hubs in plants [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/159378 / TESIS